Nat. Commun. | 用 AlphaFold-Multimer 发现 GPCR 纳米抗体

文献来源：Harvey EP*, Smith JS*, Hurley JD* et al. In silico discovery of nanobody binders to a G-protein coupled receptor using AlphaFold-Multimer.Nature Communications, 2026. DOI: 10.1038/s41467-026-72093-5 通讯作者：Andrew C. Kruse & Katherine J. Susa（哈佛医学院 / UCSF）

目录

1. 1. 研究背景与动机
2. 2. 核心科学问题
3. 3. 研究策略与方法体系
4. 4. 关键结果
5. 5. 方法学细节与实验验证
6. 6. 讨论与局限性
7. 7. 与同期相关工作的比较
8. 8. 意义与展望
9. 9. 值得关注的细节

一、研究背景与动机

1.1 抗体药物的现状与挑战

抗体是最重要的生物药物类别之一。截至2020年，全球已有超过100种单克隆抗体获批上市，超过800种处于临床试验阶段，构成增速最快的药物类群。其核心优势在于对靶蛋白的高度特异性识别、可工程化的慢解离速率（低 ），以及有利的药代动力学特性（长半衰期）。

然而，传统抗体发现流程面临系统性瓶颈：

尤其是 G 蛋白偶联受体（GPCR）这一最重要的药物靶点家族，约占 FDA 批准药物的 35%，但 GPCR 靶向抗体极度匮乏：截至2021年，在所有临床开发中的 GPCR 靶向药物里，抗体类型不足1%，获批 GPCR 单克隆抗体仅3种。根本原因在于 GPCR 构象动态性强、重组蛋白产量低，难以满足传统抗体发现流程所需的高质量样本要求。

1.2 纳米抗体（Nanobody / VHH）的独特价值

纳米抗体是来自骆驼科动物（骆驼、单峰驼、羊驼等）的单域重链抗体可变区片段（VHH），分子量约 12–15 kDa，约为传统抗体（150 kDa）的十分之一。其结构特点赋予其独特优势：

• • 单链结构：无轻链，便于计算建模与虚拟筛选
• • 长突出的 CDR3 环：可深入 GPCR 跨膜束，靶向传统抗体难以触及的正位结合口袋（orthosteric site）
• • 理化稳定性好：热稳定性高，可在多种条件下维持活性
• • PDB 结构丰富：2015年至2023年，PDB 中纳米抗体-GPCR 复合物结构从寥寥数个迅速增长至逾150个，为计算预测提供了丰富训练数据

目前已有1个纳米抗体（caplacizumab，靶向 vWF，用于血栓性血小板减少性紫癜）获 FDA 批准，多个处于临床开发阶段。

1.3 AlphaFold-Multimer 的崛起与局限

自2021年 AlphaFold2 发布以来，蛋白质结构预测发生了根本性变革。AlphaFold-Multimer（AF-M） 是其专门针对蛋白质复合物预测优化的版本，通过以下信息源进行结构推断：

1. 1. 多序列比对（MSA）：利用同源蛋白序列中的共进化信号推断接触残基
2. 2. 蛋白质数据库（PDB）结构模板：利用已知三维结构进行同源建模
3. 3. 深度神经网络：端到端学习序列到结构的映射关系

然而，抗体-抗原之间不存在共进化关系（抗体序列由 V(D)J 重组产生，与抗原无共进化历史），这使得 MSA 的共进化信号对抗体预测几乎无贡献。AF-M 对抗体-抗原复合物的预测完全依赖 PDB 结构模板。这一限制长期以来被视为 AF-M 用于抗体发现的根本性障碍。

二、核心科学问题

本研究围绕三个递进的核心科学问题展开：

Q1：AF-M 能否准确预测纳米抗体-GPCR 复合物的结构，包括训练截止后发表的新型构象？

Q2：AF-M 的置信度指标是否能有效区分真实结合与非结合的纳米抗体-GPCR 对？其判别性能是否具有 GPCR 特异性？

Q3：能否基于 AF-M 构建完全计算驱动的前瞻性筛选流程，从随机虚拟文库中发现具有真实结合活性和功能活性的 GPCR 纳米抗体？

三、研究策略与方法体系

3.1 总体技术路线

虚拟纳米抗体文库设计（10,000 条）
        │
        ▼
AF-M 大规模结构预测（无模板模式）
        │
        ▼
多维度置信度指标提取与 LCF 综合评分
        │
        ▼
候选命中分子排名与过滤（LCF > 阈值，去除生化缺陷序列）
        │
        ▼
重组表达纯化（Fc 融合体 / 单体）→ 细胞结合实验 → 功能验证
        │
        ▼
结合位点验证（定点突变 + AF-M 预测位点比对）

3.2 基准测试集的构建

在进行前瞻性筛选之前，研究团队首先系统评估 AF-M 的判别能力，构建了三类基准测试集：

非结合对照通过置换配对（permutation）生成：将纳米抗体与其非同源抗原随机配对，并通过 BLAST 同源性搜索确认各抗原之间无过近的序列相似性，以避免数据泄露。

关键发现：AF-M 对 GPCR 纳米抗体的判别能力显著优于其他靶点类型，提示 PDB 中大量 GPCR-纳米抗体结构（>150个）在训练中发挥了关键作用，形成了特异性的"GPCR-nanobody识别能力"。

3.3 置信度指标体系与线性组合特征（LCF）

研究团队系统提取并评估了以下 AF-M 输出指标：

全局指标：

• • avg_pTM：五个模型的平均预测模板建模得分（AUROC = 0.73）
• • best_pTM：最高置信度模型的 pTM（AUROC = 0.71）

界面特异性指标（界面定义：链间 Cα–Cα 距离 ≤ 10 Å 的残基对）：

• • avg_iPAE：平均界面预测对齐误差（AUROC = 0.69；数值越低越好）
• • best_iPAE：最优模型的界面 PAE（AUROC = 0.68）
• • avg_ipLDDT：平均界面预测局部距离差异检验（AUROC = 0.67）
• • best_ipLDDT：最优模型的界面 pLDDT（AUROC = 0.65）
• • avg_model_support：界面接触在五个模型中的平均出现频率（AUROC ≈ 0.65）
• • best_pDockQ：最优模型的预测对接质量评分（AUROC = 0.66；与 pLDDT 高度相关）

线性组合特征（Linear Combination Feature, LCF）：

将上述六个独立指标（去除冗余的 best_pDockQ）各自归一化至 [0, 1] 区间后，计算乘积：

LCF 的整体 AUROC 为 0.71，略低于单指标最佳值（0.73），但精准率曲线下面积（AUC5%）表现突出——在排名最高的5%纳米抗体中，LCF 和各组成指标的精准率均达到 0.93–1.0，意味着前5%候选物中几乎全为真阳性结合物。

3.4 虚拟纳米抗体文库设计

文库设计遵循 McMahon et al. (2018) 已发表的酵母展示文库规范，关键参数如下：

• • 文库规模：10,000 条序列
• • CDR3 长度分布：7 / 11 / 15 个残基（三类等比例）
• • 氨基酸采样：各 CDR 位置的氨基酸按已发表文库的氨基酸频率分布独立采样；绝大多数位置排除半胱氨酸和甲硫氨酸（避免氧化和二硫键问题）；部分位置使用受限氨基酸集合（与原文库设计一致）
• • 框架区（FR）：沿用已验证的 VHH 骨架序列，仅 CDR 区随机化

重要说明：此文库为完全随机设计，不含任何已知 GPCR 结合序列，也未针对 MRGPRX2 做特异性富集。这是验证计算方法有效性的关键控制条件。

3.5 AF-M 运行参数

使用修改版本的 ColabFold 本地脚本，运行于配备 NVIDIA A100 GPU 的 Lambda Labs 服务器：

• • 版本：AF-M Multimer v2 / v3
• • 循环次数（recycles）：3
• • 模板：关闭（no_templates，防止特定结构偏倚）
• • Amber 后处理：关闭
• • 每对预测：5个模型

四、关键结果

4.1 AF-M 准确预测训练截止后的新型 GPCR-纳米抗体结构

测试案例：GPCR AT1R（血管紧张素II I型受体）与合成纳米抗体 AT118-H 的复合物（PDB: 8TH3，2024年发表，晚于AF-M训练截止日期2021年9月30日）。

AF-M 预测结果与实验冷冻电镜结构高度吻合：

值得注意的是，AT118-H 诱导 AT1R 采取一种前所未见的混合构象——胞外侧呈激活态，胞内侧呈非激活态。AF-M 不仅预测了结合，还正确推断出这一罕见构象，说明其并非简单复现已知模板，而是学会了推断微妙的结构特征。

4.2 对 MRGPRX2 的虚拟筛选及命中率

筛选漏斗统计：

10,000 条虚拟纳米抗体
    └─ 去除含潜在生化缺陷序列（糖基化位点、预测多反应性）→ 去除 25%（2,500条）
         └─ LCF > 阴性对照最高 LCF 阈值 → 179 条（1.79%）
              └─ 预测结合于胞外区 → 177 条（177/179，99%）
                   └─ 去除额外缺陷 → 选取 Top 6 + 4 条低排名对照 = 10 条
                        └─ 表达纯化后细胞结合实验 → 4 条阳性
                             └─ 生化行为良好 → 3 条进入完整验证

命中率：10条实验候选物中，3条（30%）获得高亲和力结合并有功能活性，且均排名靠前（rank 1, 5, 7），体现了 LCF 排名的预测价值。

4.3 三条命中纳米抗体的结合特性

三条纳米抗体均在内源性表达 MRGPRX2 的 ROSA 肥大细胞系和异源转染 MRGPRX2 的 HEK293T 细胞上表现出一致的特异性、剂量依赖性结合，而在转染空载体的 HEK293T 细胞上无结合信号。

4.4 功能性拮抗活性验证

β-氨基己糖苷酶释放实验（肥大细胞脱颗粒）：

• • MRGPRX2 小分子激动剂 Compound 48/80 诱导约 70% 的脱颗粒释放
• • Sim8619、Sim9877、Sim4784 单独处理均不引发脱颗粒（非激动剂）
• • 三条纳米抗体均能显著抑制 48/80 诱导的脱颗粒（功能性拮抗剂）

Gi TRUPATH BRET 信号转导实验（G蛋白活化）：

• • Sim8619 单独处理仅在高浓度（相对于48/80的EC50）时引起微弱 Gi 活化
• • Sim8619 预处理后显著降低 48/80 激活 Gi 的最大效应（Emax 下降）并右移 EC50
• • 类似效果在另一结构不同的 MRGPRX2 肽类激动剂 Substance P 处理中也能观察到

这两项实验共同证明三条纳米抗体为功能性竞争性（或部分竞争性）正位拮抗剂。

4.5 AF-M 预测结合位点的实验验证

AF-M 预测三条纳米抗体均结合于 MRGPRX2 的正位结合口袋（orthosteric binding pocket），与 48/80 的结合位点重叠，具体接触残基包括受体上的两个酸性残基 E164 和 D184。

验证策略包含多个正交实验：

（1）纳米抗体 CDR 区定点突变

（2）受体 MRGPRX2 定点突变（E164A/D184A）

Sim9877 的 CDR3 在 AF-M 模型中预测不与 E164/D184 直接接触，其结合也确实不受 E164A/D184A 突变影响——这种位点特异性的一致性强有力地支持了 AF-M 预测结合位点的准确性。

五、方法学细节与实验验证

5.1 蛋白表达与纯化

Fc 融合纳米抗体（用于细胞结合和功能实验）：

• • 表达系统：Expi293F 细胞瞬时转染（哺乳动物表达）
• • 载体：pFUSE-CHIg-hG1（含 H435A 突变，避免蛋白A亲和柱干扰）
• • 纯化：蛋白A亲和层析，透析后冻存
• • 质控：SDS-PAGE + 分析性尺寸排阻色谱（SEC）

单体纳米抗体（用于结合特异性验证）：

• • 表达系统：E. coli BL21(DE3)（pET26B 载体，C端 V5+6×His 标签）
• • 纯化：蛋白A亲和 + Ni-NTA 亲和双步纯化
• • 浓缩至 >100 μM（~1.6 mg/mL）

5.2 细胞结合实验（流式细胞术）

• • ROSA 肥大细胞：内源性高表达 MRGPRX2，经流式细胞术确认
• • HEK293T 细胞：瞬时转染 FLAG-MRGPRX2 或空载体
• • 检测方式：抗人 IgG Fc-AF488（Fc融合）或抗V5-APC（单体）二抗信号
• • Kd 计算：GraphPad Prism 非线性拟合，以负对照条件的 MFI 作为非特异性背景

5.3 β-氨基己糖苷酶脱颗粒实验

• • 激动剂浓度：Compound 48/80 @ 50 μM
• • 纳米抗体预处理：50 μM，15 min，37°C
• • 读出：荧光底物 4-MUG 在 360/460 nm 的荧光信号
• • 脱颗粒率计算：上清荧光 / (上清 + 裂解液荧光) × 100%

5.4 Gi TRUPATH BRET 信号转导实验

• • 系统：HEK293T 细胞瞬时转染 FLAG-MRGPRX2 + Gi TRUPATH 质粒（BRET 传感器）
• • 激动剂模式：纳米抗体 @ 20 μM，检测 ~10 min 后 BRET 变化
• • 拮抗剂模式：纳米抗体 @ 10 μM 预处理 45 min，再加变浓度激动剂

六、讨论与局限性

6.1 为何 AF-M 在 GPCR 上特别有效？

研究者提出了两个互补假说：

1. 1. PDB 训练数据质量与数量效应：PDB 中 GPCR-纳米抗体结构从2015年的极少数增至2023年的150余个，且快速增长。丰富的高质量训练样本使 AF-M 能学习到 GPCR 与纳米抗体之间特异性的结构互补模式。
2. 2. 结合姿态的刻板性（stereotyped binding poses）：相比可溶性蛋白，纳米抗体结合 GPCR 的方式具有相对保守的位置偏好（主要从胞外区进入跨膜束），这种刻板性有助于模型形成规律性认识。

对比实验中，ESMFold（蛋白质语言模型）无法区分 GPCR 纳米抗体真假结合对（AUROC ≈ 0.5），AlphaFold3 对 GPCR 的表现（ipTM AUROC = 0.74）与 AF-M 相当，但在非GPCR膜蛋白上同样失效。

6.2 目标靶点选择的合理性与局限性

选择 MRGPRX2 的依据：

• • 浅表结合口袋（shallow binding pocket）→ 对结合配体的宽容度更高，适合首次验证
• • 灵长类特有受体，序列与 MRGPRX1/3/4 同源性低，减少其他 GPCR 训练数据的混淆
• • 临床价值明确：目前无 FDA 批准药物靶向此受体

局限性：

• • 是否能推广至其他（尤其是结合口袋更深、结构更严苛的）GPCR 靶点，尚待验证
• • MRGPRX2 的"宽容"结合特性可能使其比典型 GPCR 更容易筛选

6.3 技术局限性

1. 1. 合成文库纳米抗体的生化行为：免疫后来源的纳米抗体经过体内亲和力成熟，通常生化行为更佳；本研究中所有候选抗体均有部分聚集体（SEC空隙峰），这是合成文库纳米抗体的普遍问题。
2. 2. 结构验证缺失：由于 MRGPRX2 重组蛋白纯化量不足，未能获得纳米抗体-MRGPRX2 复合物的实验结构（冷冻电镜或晶体学），精确结合姿态仅由突变实验间接支持。
3. 3. LCF 指标的内在局限：AUROC = 0.71–0.73 意味着仍有相当比例的假阳性和假阴性；当筛选更有挑战性的 GPCR 靶点时，可能需要更大的虚拟文库，计算成本显著上升。
4. 4. 拮抗机制的不确定性：竞争实验支持正位拮抗，但 Emax 下降而非完全阻断（特别是在浓度依赖性曲线中）提示可能涉及不完全竞争或变构成分，需进一步机制研究。

七、与同期相关工作的比较

本研究的核心区分点在于：无需实验筛选步骤的纯计算前瞻性筛选——从序列设计到结合位点验证，理论上全程可在计算环境中完成，实验仅用于最终验证。这一特点使其在降低初期筛选成本方面具有独特优势。

八、意义与展望

8.1 对药物发现的直接意义

• • MRGPRX2 相关疾病：发现的三条拮抗纳米抗体（Sim8619, Sim9877, Sim4784）具有先导化合物价值，有望用于慢性自发性荨麻疹（chronic spontaneous urticaria）、药物诱导的假过敏反应（如造影剂、肌松药所致的 IgE 非依赖性肥大细胞激活）等适应症。
  • • 值得注意的是，Harvey等人及其合作者已就 MRGPRX2 拮抗纳米抗体提交专利申请。
• • GPCR 抗体治疗空白：目前 GPCR 抗体在 FDA 批准药物中严重欠代表（<1%），本方法体系有望系统性加速 GPCR 靶向抗体药物的早期发现阶段。

8.2 方法学发展方向

提升精度的可能路径：

• • 持续增长的 PDB GPCR-纳米抗体结构数据将自动改善 AF-M 表现
• • AlphaFold3 及后续版本有望进一步提升预测精度（当前 AF3 GPCR AUROC = 0.74，与 AF-M 相当）
• • 针对 GPCR 特异性的微调（fine-tuning）模型

扩展至其他靶点类型：

• • 对于当前 AF-M 表现不佳的靶点（可溶性蛋白、非GPCR膜蛋白），可结合 RFdiffusion、Chai-2 等生成模型进行互补
• • 引入贝叶斯优化（Bayesian optimization）/ 主动学习（active learning）：以小批量实验反馈指导下一轮虚拟文库设计，更高效探索抗体化学空间

计算成本优化：

• • 更大规模的虚拟文库（>100,000条）对于挑战性靶点可能必要，需发展更高效的计算流程

8.3 更广泛的科学意义

本研究是AI 工具直接产生经实验证实的科学发现的一个完整、严格的范例，具体体现在：

1. 1. 严格的训练/测试集分离（使用训练截止后的结构作为测试案例）
2. 2. 多正交实验验证（细胞结合、功能实验、定点突变）
3. 3. 透明的方法学报告（代码开源于 GitHub）

随着 AI 蛋白质结构预测模型的持续迭代和 PDB 数据的不断积累，类似的"计算驱动 → 少量实验验证"范式有望成为生物药物早期发现的主流路径之一。

值得关注的细节

关于 LCF 设计哲学： 研究者选择将六个指标的归一化值相乘（而非相加或取均值），这意味着任何一个指标极低都会导致 LCF 趋近于零——相当于一个"严格与"（AND gate）逻辑，只有各方面置信度均高的预测才能获得高 LCF。这一设计有效提升了前5%筛选的精准率（AUC5% = 0.93–1.0），代价是整体 AUROC 略低于单个最优指标。

关于 Sim4177（rank 90）的经验教训： Sim4177 在细胞结合实验中显示阳性信号，但生化行为不佳（SEC 分析显示严重聚集），最终被排除。这提示即使是计算预测的"命中"，仍需通过生化质控把关，合成文库纳米抗体的生化行为问题不容忽视。

关于 MRGPRX2 与训练数据的关系： MRGPRX2 的结构（PDB）发表于 2021年底，晚于 AF-M 训练截止日期（2021年9月30日），因此 AF-M 在预测时并未包含 MRGPRX2 自身结构的直接信息。这一设计排除了"数据泄露"的可能，使筛选结果更具说服力。