J. Am. Chem. Soc. | AlphaFold3 实现共价药物发现

前瞻性发现高效选择性 BTK 共价抑制剂

原文信息 Shamir Y, Gabizon R, Rogel A, Lin DY, Andreotti AH, London N. Discovery of Covalent Ligands with AlphaFold3. Journal of the American Chemical Society, 2026. DOI: 10.1021/jacs.5c22222 通讯作者：Nir London，魏茨曼科学研究所化学与结构生物学系

摘要速读

本文报道了一项里程碑式工作：将 Google DeepMind 的全原子结构预测模型 AlphaFold3（AF3） 首次系统性地应用于共价配体的虚拟筛选（covalent virtual screening），并在前瞻性筛选实验中成功发现了结构全新的 BTK 共价抑制剂。

核心贡献如下：

1. 1. COValid：首个专门用于共价虚拟筛选富集分析的基准数据集（874 个活性分子 + 37,919 个性质匹配诱饵分子）
2. 2. 方法论突破：AF3 的 mPAE 指标在全部 10 个靶点位点均大幅优于传统共价对接工具（71.8% vs ~10%，Adjusted LogAUC）
3. 3. 实验验证：前瞻性筛选发现 YS1，IC₅₀ = 30 nM（体外），107 nM（细胞），晶体结构验证预测精度达 0.50 Å RMSD

一、研究背景与科学问题

1.1 共价抑制剂的重要性

共价抑制剂（covalent inhibitors）通过与靶蛋白上的亲核氨基酸残基形成不可逆（或可逆）共价键来发挥作用。相较于非共价抑制剂，其优势包括：

• • 更高效力：持续占据靶点，即使药物浓度降低后仍保持活性
• • 更长靶点占用时间（target engagement）：不受药动学波动影响
• • 潜在的选择性优势：可利用特定位置的半胱氨酸等氨基酸进行精准定向

截至目前，FDA 已批准超过 50 种共价药物，近年代表性品种包括：

1.2 共价虚拟筛选面临的挑战

共价结合是一个两步动力学过程：

E + I  ⇌  E·I  →  E-I（共价加成物）
       KI      kinact

其中：

• • 第一步：可逆非共价识别（KI，由分子识别决定）
• • 第二步：共价键形成（kinact，由反应活性与空间朝向决定）

传统共价对接软件（DOCKovalent、DOCK6、AutoDock 等）存在以下根本性缺陷：

1. 1. 只对已成键的加成物状态（adduct state）打分，完全忽略共价反应前的过渡态空间朝向
2. 2. 无法量化亲电试剂的固有反应活性，导致多弹头共价库（multi-warhead library）的排序不可行
3. 3. 使用固定蛋白骨架，难以处理配体诱导的构象变化（induced-fit effects）
4. 4. 缺乏标准化富集评估基准：非共价筛选领域有 DUD-E、DUDE-Z 等成熟基准，共价领域从未有过

正是这一空白，催生了本文的核心工作。

二、COValid——首个共价虚拟筛选富集基准数据集

2.1 数据集设计原则

COValid 的构建借鉴了非共价领域 DUD-E 的两大核心原则：

原则 1：物化性质匹配（property matching） 诱饵分子与活性分子在以下 6 个性质上保持高度匹配，避免因性质差异导致的人为富集：

• • 分子量（MW）
• • 氢键供体数（HBD）
• • 氢键受体数（HBA）
• • 可旋转键数（rotatable bonds）
• • 净电荷（net charge）
• • 脂水分配系数（cLogP）

原则 2：拓扑不相似性（topological dissimilarity） 通过打乱分子骨架连接方式生成诱饵，确保其与活性分子组成相似但拓扑不同，从而排除因化学相似性导致的假阳性富集。诱饵骨架均选自 ZINC20（商业可及化合物数据库），保证化学合理性。

2.2 数据集组成

注：本研究聚焦于丙烯酰胺（acrylamide）弹头——最常见的靶向半胱氨酸的共价弹头，兼顾实用性与可比较性。

三、AlphaFold3 共价共折叠（Covalent Cofolding）方法

3.1 AF3 的输入与输出

AF3（2024 年 11 月发布）首次实现了全原子生物分子结构预测，支持共价蛋白-配体复合物的预测。

输入：

• • 蛋白质氨基酸序列
• • 配体的几何优化 3D 构象（SMILES → 3D）
• • 共价键指定：配体原子编号 + 蛋白侧链原子

输出：

• • 预测的共价复合物三维坐标
• • 多种置信度指标矩阵（PAE、pTM、ipTM 等）

相比传统对接的关键优势：

• • 无需晶体结构，仅需蛋白序列
• • 允许蛋白骨架柔性（backbone flexibility）
• • 可建模配体诱导的构象变化（如 BTK P-loop 重排）
• • 可暴露隐蔽口袋（cryptic pockets）

3.2 关键指标：mPAE（最小预测对齐误差）

PAE（Predicted Aligned Error）矩阵是 AF3 输出的结构置信度矩阵，其中元素 (i, j) 表示：以 token i 为参考对齐时，token j 位置的预测误差（单位：Å）。

研究者定义：

即：以所有配体原子为参考对齐时，所有蛋白残基位置预测误差的最小值。

mPAE 相较其他置信度指标的优势：

mPAE 的物理意义：反映配体与蛋白之间最紧密接触区域的结构置信度，本质上是对结合界面几何互补性的度量，而非简单的全局置信度。

3.3 mPAE 的绝对值与结合概率

在 COValid 适用范围内，mPAE 的绝对值具有前瞻性筛选意义：

这一单调递减关系为设定筛选截断值（cutoff）提供了理论依据。

四、基准测试结果

4.1 COValid 上的富集性能对比

富集度量指标：Adjusted LogAUC

• • 0%：随机水平
• • 85.5%：理论最优（所有活性分子均排在所有诱饵之前）
• • 强调早期富集（early enrichment），更贴近实际筛选需求

值得注意的细节：

• • AF3 + Rosetta 重打分（纯物理打分，不依赖 AI 置信度指标）已显著优于传统对接，说明 AF3 生成的结构模型物理合理性足够好
• • mPAE 在此基础上进一步大幅提升（28.5% → 71.8%），说明 AF3 内置的置信度信息具有独立的预测价值
• • 各位点 AUC（ROC 曲线下面积）范围：0.9082 ~ 0.9996，几乎接近完美分类

4.2 消融实验：排除训练数据泄露的可能

潜在偏差：AF3 的训练集包含大量 PDB 结构，若测试化合物与训练集重叠，则富集性能可能被高估。

研究者的消融策略：按 Tanimoto 相似性（Morgan 指纹，radius=2，2048 bits）过滤与 PDB 中任何分子相似的活性化合物（及其对应诱饵），在 Tc = 0.4 严格截断下（过滤掉大多数活性分子后），富集性能几乎不受影响。

此外，64 个"实验诱饵"（ChEMBL 中被测试过但活性 > 10 μM 的丙烯酰胺化合物）的 mPAE 均值为 1.5 ± 0.5 Å，与活性分子形成显著区分（86% 的实验诱饵 mPAE > 0.95 Å）。

4.3 非共价虚拟筛选：在 DUDE-Z 上的表现

将 AF3 + mPAE 推广到非共价领域（DUDE-Z 基准，43 个靶点）：

• • 在 42/43 个靶点中，AF3 显著优于 DOCK3.7 和 DOCK6.9
• • 激酶靶点平均 Adjusted LogAUC：60.7 ± 11.1%（优于非激酶靶点的 47.5 ± 21.3%）
• • 与 Boltz-2（另一 AI 共折叠模型）性能相近

五、前瞻性筛选：发现 BTK 全新共价抑制剂

5.1 筛选流程

靶点：BTK（布鲁顿酪氨酸激酶）Cys481，B 细胞恶性肿瘤的重要治疗靶点，已有 Ibrutinib、Zanubrutinib、Acalabrutinib、Rilzabrutinib 等多个 FDA 批准的共价抑制剂。

筛选流程：

构建虚拟库（~906K 含丙烯酰胺化合物）
        ↓
AF3 预测各化合物与 BTK Cys481 的共价复合物结构
        ↓
按 mPAE 排序，保留 mPAE < 0.9 Å 的化合物（440 个，~0.05%）
        ↓
过滤与已知 BTK 抑制剂相似的化合物（Tc > 0.35）
        ↓
聚类分析 + 人工审查（多样结合模式）→ 390 个候选
        ↓
合成 13 个代表性化合物
        ↓
实验评价（LC/MS、激酶抑制、细胞实验、晶体学）

5.2 三个主要苗头化合物

YS1（最优命中）：

• • LC/MS 蛋白标记：在 1 μM / 2 h 条件下达到接近 100% 共价标记率
• • IC₅₀（体外 BTK 抑制）：30 nM
• • IC₅₀（细胞水平，Mino 细胞）：107 nM（BTK 自磷酸化抑制）
• • 选择性：激酶组学（362 个激酶，300 nM）仅 6 个激酶抑制 > 40%（3 个为 TK 组家族成员：JAK3 85.1%、BMX 95.3%、TEC 45.6%）
• • 蛋白质组学选择性：Probe 4 竞争实验中，全细胞蛋白质组（3416 个蛋白）中仅 TEC 激酶显著被竞争
• • kinact/KI = 915.85 M⁻¹s⁻¹；kinact = 0.004887 s⁻¹；KI = 5.34 μM

YS2：

• • IC₅₀（体外）：77 μM
• • 分辨率 1.27 Å 晶体结构（PDB: 9ZLM），RMSD = 0.41 Å
• • 延伸至 BTK "背口袋"（back pocket），与 Gatekeeper 和 C-helix 之间的空间相互作用

YS3：

• • IC₅₀（体外）：8.4 μM
• • AF3 预测与晶体结构存在偏差（约 1 个键旋转的差异），推测与多构象结合模式有关
• • 与 CC-292 的结合口袋相似，后者也已知具有多构象

5.3 YS1 的结合模式：全新口袋发现

晶体学揭示了 YS1 与 BTK 结合的独特模式：

YS1 并非传统的 front-pocket 或 back-pocket 结合剂，而是从 P-loop（甘氨酸富集环）下方伸入，将其氯代苯基延伸至由以下残基围成的全新亚口袋：

• • M437（靠近 N-lobe 的 C-helix 附近）
• • L542 / Y545 / V546（激活环 N 端）

这一结合模式伴随：

• • P-loop 向开放构象重排（accommodating the ligand）
• • F413 侧链采取异常朝向（指向 ATP 结合口袋而非激活环）
• • Y551 未进入"被隔离状态（sequestered state）"，与 front-pocket 抑制剂不同

意义：YS1 的发现拓展了我们对 BTK 可成药口袋的认知，揭示了一个此前未被利用的新亚口袋，为克服 BTK 抑制剂耐药性提供了新的结构基础。

5.4 晶体结构验证 AF3 预测精度

YS1 AF3 预测还正确判断了环己基的反式（trans）异构体构型。

六、深度讨论

6.1 AF3 何以优于传统对接？

结构原因分析：

1. 1. 共价键位点指定：明确指定共价键位点可将 AF3 的结合口袋预测准确率从 81% 提升至 93%（原 AF3 论文数据）
2. 2. 蛋白骨架柔性：AF3 可采样蛋白骨架构象空间，处理 induced-fit 效应。相比之下，传统对接使用固定骨架——当 DOCKovalent 用相同库对 BTK 进行静态结构对接时，YS1 仅排在第 15 百分位（AF3 mPAE 方法排在前 0.05%），且对接构象与晶体结构不符（F413 侧链产生碰撞）
3. 3. 隐蔽口袋采样：AF3 暴露了 YS1 结合的 P-loop 下方新亚口袋
4. 4. E2E 学习的隐性物理知识：Rosetta 重打分 AF3 模型即可优于传统对接，表明 AF3 生成的结构具有足够的物理合理性

6.2 mPAE 的本质与局限

为何 mPAE 有效但 mPAE 与亲和力无关？

这是本文一个深刻且反直觉的发现：mPAE 与结合亲和力（如 IC₅₀、Kd）无显著相关性（Pearson r = 无显著相关），但它能有效区分活性/非活性分子。

作者的解释：mPAE 是一个"粗粒度（coarse-grained）"的分类指标，本质上反映的是配体是否能在预测结合口袋中形成稳定的、几何合理的结合模式，而非结合自由能的精确量化。这与 Masters et al.（2025）的研究结论一致：AF3 等共折叠模型并不依赖精确的物理相互作用来放置配体，而是基于训练集中的统计模式。

选择性预测的局限： 交叉对接实验（cross-docking）显示，对于位点相近的激酶（如 BTK、BMX、ITK 等均含有 Cys 在同源位置），mPAE 无法有效区分。因此 mPAE 目前不适用于激酶选择性预测。

6.3 实用性的瓶颈与解决方案

速度瓶颈：每个配体约需 266 秒（不含蛋白 MSA 生成的 ~22 分钟），对数十亿量级的超大型虚拟库筛选不可行。

建议的级联筛选策略：

超大型虚拟库（10⁹ 量级）
        ↓ 快速传统对接（毫秒/分子）
前 10⁶ 候选
        ↓ AF3 + mPAE 精筛（~266 s/分子）
最终候选（~0.05%）
        ↓ 实验合成与验证

弹头多样性限制：本研究仅针对丙烯酰胺弹头（靶向 Cys），无法处理多弹头库中不同亲电试剂反应活性差异的问题。扩展至其他弹头类型（靶向 Ser、Lys、Tyr、His）和其他亲核残基是重要的未来方向。

6.4 AF3 的物理局限性

若干研究表明 AF3 存在物理建模的缺陷：

• • YS3 的错误预测：将疏水基团朝向溶剂，可能反映 AF3 对疏水效应（hydrophobic effect）建模不足（与 Childs et al. 2025 一致）
• • 共价键几何畸变：AF3 共价共折叠倾向于产生键长/键角几何不合理的共价键，但整体配体姿态仍然准确（结构"补偿"）
• • 不依赖精确物理相互作用：Masters et al.（2025）的对抗性实验（adversarial experiments）表明，AF3 对结合位点局部突变不敏感

这些局限性提示：将 AF3 的统计学习与物理化学知识（如 Rosetta 能量函数、力场）结合，是未来改进共折叠方法的重要方向。

七、与相关工作的比较

八、方法学要点（对实践者的启示）

8.1 如何复现/应用本方法

1. 1. 蛋白输入：仅需氨基酸序列（无需晶体结构），AF3 服务器免费可用（alphafoldserver.com）
2. 2. 配体输入：SMILES → 三维构象生成（如 RDKit、OMEGA）→ 指定共价键原子对
3. 3. 关键参数：
   • • mPAE 阈值建议：< 0.9 Å（约 0.05% 命中率，可按需调整）
   • • 相似性过滤：Tc < 0.35（Morgan 指纹）排除与已知抑制剂相似的化合物
4. 4. 计算资源：MSA 生成约需 22 min/蛋白（20 CPU），AF3 推理约 266 s/配体（GPU，型号依赖）

8.2 注意事项

• • 对于已有大量已知抑制剂的靶点（如 BTK），需严格进行新颖性过滤（novelty filter），避免重发现已知骨架
• • mPAE 在同源位点的激酶之间分辨率有限，选择性评估仍需体外实验
• • YS3 案例提醒：对 AF3 预测构象存疑时，应进行晶体学验证，不能完全信赖预测结合模式
• • 对于共价键几何（键长/键角），AF3 预测可能偏差较大，需结合化学合理性判断

九、总结与展望

核心结论

本文通过以下五点系统性地证明 AF3 可以实际用于共价药物发现：

1. 1. ✅ 构建了 COValid，填补了共价 VS 基准数据集的空白
2. 2. ✅ 证明 AF3 mPAE 指标在所有测试靶点均大幅优于传统共价对接工具
3. 3. ✅ 证明其优越性不依赖训练数据泄露（消融实验）
4. 4. ✅ 在非共价 VS（DUDE-Z）上同样优于传统方法
5. 5. ✅ 前瞻性发现了全新骨架的 BTK 共价抑制剂 YS1，并通过晶体学验证了 AF3 预测的亚埃精度

对领域的影响

• • 方法论层面：为 AI 辅助共价药物发现提供了经过充分验证的工作流程
• • 药物发现层面：开启了利用蛋白构象柔性进行大规模虚拟筛选的新时代，对传统对接难以处理的柔性靶点尤为重要
• • 生物学层面：YS1 揭示了 BTK 的全新结合亚口袋，为克服 BTK 抑制剂耐药性提供新思路

未来方向

• • 扩展至非激酶靶点的系统性验证
• • 开发针对 Ser、Lys、Tyr、His 等其他亲核残基的弹头，配合 AF3 共折叠
• • 融合物理化学能量函数改善 AF3 对疏水效应的建模
• • 建立 AF3 + 快速对接的级联筛选流程，适配十亿量级超大型虚拟库
• • 探索 AF3 建模共价反应中间态（prereaction state）的可行性，以更好捕捉 kinact 相关信息