文献分享--单细胞Stereo-seq揭示驱动急性肾损伤中受损近端小管再生的调控机制

作者，Evil Genius

我们大多数作为学生，课题组的人，主要的任务就是数据分析，平台的选择等大的方向我们一般决定不了，等拿到数据的时候已成定局，只能在数据的基础上进行分析。

所以根本上还是要提升分析能力，但是分析能力无法量化，也没有明确的界限，就像一粒米到一个米堆的变化，到底哪一粒米添加进去，就成了米堆，没有很明确的界限。

这也是现在生信求职的一个问题，能力高低很难量化出来，而发表文章就成了硬通货。但是发表一篇文章又是综合能力的体现，不仅仅是数据分析。

今日我们分享stereo-seq文献,NC就是大课题组和小课题组的界限。

核心问题：急性肾损伤（AKI）中，近端小管（PT）细胞在修复中发挥核心作用，但促进修复的特定PT群体和状态仍不清楚。

摘要

急性肾损伤（AKI）是一种以肾功能迅速下降为特征的临床综合征。近端小管（PT）细胞在AKI中发挥核心作用。然而，促进修复的特定PT群体和状态仍不清楚。

• 结合空间增强分辨率组学测序（Stereo-seq） 与单核RNA测序（snRNA-seq） 对AKI期间的肾脏转录组进行分析。
• 识别出一种缺血-再灌注损伤诱导的PT亚型，称为增殖性PT（proliferative PT），可能启动肾脏再生，其基因表达富集于有丝分裂和代谢过程。
• Acsm2在增殖性PT中表达，与细胞周期进程相关。功能研究通过缺陷和过表达小鼠揭示了Acsm2的保护作用。
• 最后，识别出一个成纤维细胞亚群（FIB_C2），通过与增殖性PT的细胞-细胞通讯参与PT修复。
• 该研究提供了AKI的整合高分辨率时空图谱，并揭示了Acsm2在肾脏再生中的重要作用。

Introduction

1. AKI的临床负担

• AKI影响约10-15%的住院患者，在重症监护病房死亡率高达50%。由缺血、脓毒症、毒素暴露或妊娠相关并发症触发。
• 尽管肾脏具有内在修复机制，但大多数患者经历不良适应修复过程，最终导致纤维化。AKI越来越被认为是慢性肾脏病（CKD）的主要驱动因素，CKD预计到2040年成为全球第五大死因。
• 尽管具有临床意义，预防AKI或积极促进功能恢复的有效治疗仍然有限。

2. 肾脏损伤后的修复与争议

• 肾脏损伤触发肾小管和肾小管间质的动态急性和慢性改变。适应性修复和不良适应修复之间的平衡关键影响肾脏结局。
• 在AKI早期，肾小管细胞死亡（凋亡、坏死性凋亡和铁死亡）是关键的致病事件，可启动向CKD的转变。
• 再生小管的细胞起源仍有争议：一些研究提示特定的CD133+CD24+祖细胞参与近端小管修复，而另一些提出所有存活细胞均有贡献。

3. 空间转录组技术的局限

• 基于NGS的方法受空间分辨率限制（Visium 55 μm，Slide-seqV2 10 μm），而原位技术（dRNA HybISS、seqFISH）受低基因通量限制（分别最多200和1,300个基因）。
• 鉴于肾脏的结构和细胞复杂性，迫切需要具有更高分辨率和更大多重能力的空间转录组技术。

4. 研究目标

• 整合单细胞Stereo-seq（高分辨率空间转录组）与snRNA-seq，对肾脏缺血-再灌注损伤（IRI）后的再生过程进行时空图谱分析。
• 识别PT的异质性亚型及其动态变化，特别是增殖性PT在再生中的作用。
• 探究Acsm2在脂肪酸代谢和细胞周期进程中的作用，并通过基因敲除和过表达小鼠验证其功能。
• 识别参与PT修复的成纤维细胞亚群（FIB_C2）及其细胞-细胞通讯机制。

Results

结果1、肾脏损伤和再生的时空单细胞分析

实验设计：

• 大鼠接受双侧肾缺血-再灌注损伤（IRI），在损伤后第0.5、1、2、3、5、7、14和21天收集肾脏进行snRNA-seq和Stereo-seq。
• PAS染色显示关键再生阶段的组织形态变化。
• 肾功能动态：BUN和Scr水平在损伤后第1天达峰值，随后逐渐恢复。

细胞类型注释：

• UMAP可视化snRNA-seq和Stereo-seq数据，注释主要肾脏细胞类型：近端小管（PT）、Henle环（LOH）、远端卷曲小管（DCT）、连接小管（CNT）、集合管（IC、A、IC、B、PC）、成纤维细胞（FIB）、免疫细胞（IMM）、内皮细胞（EC）、足细胞（POD）和周细胞（Pericyte）。
• snRNA-seq和Stereo-seq数据集之间保守标记基因一致。
• 两种方法细胞类型比例一致（组成一致性）。
• 单细胞分辨空间映射将snRNA-seq数据映射到Stereo-seq坐标，显示全肾细胞分布和肾小球/肾小管微解剖。原位杂交（ISH）验证区域特异性转录本。

结果2、肾脏损伤和再生过程中细胞比例、空间分布和增殖的动态变化

空间转录组图谱：

• 展示主要肾脏细胞类型在对照组和IRI时间点（Con、第1、3、7、21天）的空间分布。
• 突出PTS3和FIB在每个时间点的空间表达模式。

细胞组成动态：

• 堆叠条形图显示IRI后不同时间点主要细胞类型的比例组成。
• 折线图显示主要细胞类型数量变化。
• PT、FIB和免疫细胞在转录水平变化相似。

PT亚聚类：

• 对PT细胞进行亚聚类（Leiden聚类，分辨率0.4），识别出6个不同的PT亚群：PTS1_2、PTS3、增殖性PT（proliferative PT）、过渡性PT（transitional PT）、损伤性PT（injured PT） 和适应性PT（adaptive PT）。
• PTS1_2和PTS3保留经典标记基因（Slc22a6和Slco1a3），确认其节段身份。
• 损伤性PT高表达Havcr-1（肾损伤标志物）。
• 增殖性PT富集DNA复制相关基因（Top2a和Ki67）。

PT亚型动态：

• 损伤性PT在损伤后第1天积累最高，表明肾缺血-再灌注后的即时损伤。
• 增殖性PT在第1天后显著增加，在第21天后恢复至基线，表明损伤后进入细胞周期增殖。

增殖追踪：

• 在第0.5至2天，增殖性PT细胞相比其他细胞类型表现出更高的增殖率（Ki67和PCNA阳性率）。
• 细胞周期分析确认增殖性PT亚群主要处于S和G2/M期。
• CytoTRACE分析：增殖性PT、损伤性PT和过渡性PT亚型显示更高的CytoTRACE评分，提示增强的祖细胞样特征。

功能特征：

• PT S1/2和S3富集三羧酸循环（TCA）和代谢过程，与维持肾脏稳态的作用一致。
• 损伤性PT高表达损伤标记（Havcr-1），与凋亡和蛋白酶体降解通路相关。
• 增殖性PT特征为细胞周期（Ki67）和DNA复制基因（Top2a、Smc4、Ect2）的强激活。
• 过渡性PT表达与 prolonged 损伤和上皮-间充质转化（Cdh6）相关的标记，暗示该群体参与不良适应修复和AKI-to-CKD转变。

结果3、肾脏损伤和再生过程中增殖性PT的细胞轨迹和调控机制

细胞状态分类：

• 将增殖性PT、损伤性PT和过渡性PT细胞分为6个不同状态（PT_C0至PT_C5），从第0天到第3天。
• CytoTRACE分析：PT_C1-4的干细胞评分高于PT_C0和PT_C5，表明PT_C1-4细胞具有增强的祖细胞样特性。

PT_C1-4亚型注释：

• PT_C1（损伤性PT-起始）：轨迹起点，氧化应激调节因子Zfand2a、磷酸转运体Slc20a1和谷胱甘肽代谢酶Gclc表达升高，典型PT膜转运体表达降低，表明应激适应表型（抗氧化能力但溶质重吸收受损）。
• PT_C2（损伤性PT-转换）。
• PT_C3（增殖性PT-准备）。
• PT_C4（增殖性PT-加速）：轨迹终点，细胞周期基因（Top2a、Ki67、Smc4）高表达和PT转运体（Slc22a6、Slc22a8）表达恢复，表明近端小管功能和结构恢复。

拟时序轨迹：

• 支持从PT_C1到PT_C4的连续转变，提示从损伤反应向活跃增殖的渐进转变。
• GSEA：早期拟时序轨迹富集p38 MAPK信号通路和细胞对缺氧的反应，晚期轨迹富集Wnt信号和肾脏发育相关功能，支持从损伤反应到主动再生的表型转变。

空间分布：

• 空间转录组显示不同PT状态在不同时间点（Con、第0.5、1、2、3天）的空间分布。

WGCNA分析：

• 识别PT状态特异性基因模块，5个模块对应一个PT状态。
• GO富集分析显示不同PT状态的顶部富集生物过程。
• 代谢过程（黄色）和有丝分裂过程（蓝色）的hub基因排序。
• 代谢模块包括Glyat、Acsm2、Acyl、Mix）和离子转运（Slc34a1），与生理性肾小管活性的恢复一致。

结果4、Acsm2通过增强能量代谢在AKI中发挥保护作用

Acsm2的识别：

• 代谢过程模块富集于PT_4（增殖性PT-加速），为支持增殖性PT细胞和促进肾脏再生提供必需能量。
• PT_4中top 10基因中，5个基因（RGD1559960、Glyat、Cyp4a3、Acsm2、Loc688389）主要在PT中表达，其中2个（RGD1559960和Acsm2）在PT_4中特异性上调。
• ACSM2是酰基-CoA合成酶中链（ACSM）亚家族成员，催化脂肪酸激活的初始步骤。

Acsm2空间动态：

• Acsm2表达在AKI后不久显著下降，从第5天起恢复，反映整体PT群体动态。
• 在PT_C1-C4中，Acsm2转录持续上调，在第2天达峰值。
• Acsm2的增加是PT_4特异性的，而健康近端小管标记基因（Slc5a12和Slc5a2）表达水平普遍较低且未显示PT_4特异性富集。
• Acsm2表达谱与第2天PT_4中脂肪酸β-氧化和脂肪酸代谢过程的富集一致。

脂肪酸代谢与细胞周期：

• 线粒体FAO是PT中主要ATP来源，对肾脏再生至关重要。
• 脂肪酸代谢过程与细胞周期调控、细胞分裂和细胞周期相关基因（Top2a、Ki67、Cdk1、Cdk2、Ccnb1、Ccna2）相关。
• PT_C1_4和PT_C4簇中Acsm2+和Acsm2-细胞的差异基因表达分析显示Acsm2+细胞中Top2a和Ki67表达增加。
• GO和KEGG富集分析显示Acsm2+细胞中有丝分裂过程和细胞周期相关术语富集。
• 这些结果表明Acsm2介导的脂肪酸代谢可能促进PT_4中的细胞周期进程和增殖活性，从而促进成功的肾脏再生。

Acsm2 KO小鼠验证：

• 生成Acsm2敲除（KO）小鼠。
• 从Acsm2 WT和KO小鼠分离原代肾小管上皮细胞，测量OCR和ECAR。结果表明Acsm2缺失确实影响这些细胞的能量产生能力。
• 26分钟IRI模型：Acsm2缺陷小鼠表现出更严重的肾损伤（Scr显著升高、PAS染色显示组织病理损伤加剧、KIM-1表达增加）。
• Acsm2 KO小鼠显示细胞增殖受损（PCNA、Ki67和BrdU表达降低）。
• 实时PCR显示Acsm2缺失导致Cdk2、Cyclin E1和PCNA表达下调。
• Western blot确认CDK2、Cyclin E1和PCNA蛋白水平相应降低。
• 这些结果表明Acsm2缺陷通过损害肾小管增殖能力加剧肾损伤并延迟肾脏修复。

Acsm2过表达验证：

• 通过超声-微泡技术（非侵入性）在IRI后第1天将Acsm2编码质粒转染到肾脏。
• IRI第1天各组小鼠Scr水平无差异（肾损伤水平可比，接近基线）。
• ACSM2过表达成功（IHC确认）。
• ACSM2过表达减少肾小管损伤（PAS染色），增加PCNA、Ki67和BrdU阳性细胞。
• 实时PCR和Western blot显示PCNA、CDK2和Cyclin E1表达增加。
• 体外实验（H/R）显示ACSM2过表达增加PCNA、CDK2和Cyclin E1蛋白表达。
• 这些结果表明Acsm2通过增强能量代谢促进肾脏修复，在AKI中发挥保护作用。

结果5、成纤维细胞在肾脏修复过程中与增殖性PT相互作用

FIB亚聚类：

• 3个FIB群体具有 distinct 基因表达谱：
  • FIB.C1：主要表达col3a1和col6a3。
  • FIB.C2：除胶原基因外，还表达代谢酶相关基因（Hao2和Sult1c2a）。
  • FIB.C3：表达离子通道相关基因（Cal2、Clcnkb）。
• 免疫细胞亚聚类为淋巴细胞（LYM）、树突状细胞（DC）和巨噬细胞（Mac）。

细胞-细胞通讯分析：

• mergeCellChat比较PT_C1_C4、FIB和免疫细胞之间的相互作用。
• netVisual_heatmap显示FIB.C2亚簇与每个PT亚簇建立了更强的信号相互作用，特别是PT_C1和PT_C4。
• CellChat circle图显示成纤维细胞对PT_C1-C4的影响强于免疫细胞，其中FIB.C2发挥主导影响。
• FIB.C2表现出增强的解毒代谢活性（Hao2、Cyp4a3、Sult1c2a和Agxt2高表达）。与经典肌成纤维细胞不同，FIB.C2可能参与缓解组织损伤的代谢过程，与对照样本相比，该功能在中后期增强。

配体-受体对：

• FIB.C2和PT亚组之间约30个最高概率的配体-受体对。
• FIB.C2和PT细胞之间最高的细胞-细胞通讯由Spp1相关信号通路介导，主要通过其与Cd44或整合素家族（Itgav、Itga9和Itgb1）受体的相互作用。
• 成纤维细胞和PT细胞通过SPP1信号通路的相互作用主要由FIB.C2亚组介导。
• Spp1在FIB.C2中的空间分布模式及其在PT.C4中的配体。
• 该特定配体-受体信号轴在第2天和第3天显示增强的相互作用强度，表明成纤维细胞-上皮细胞串扰在此期间时间调控性增强。
• SPP1信号主要通过成纤维细胞衍生的SPP1作为旁分泌信号分子激活PT细胞上的整合素受体，促进上皮-间充质串扰。

空间背景：

• 肾脏损伤后FIB.C2和PT.C4的空间背景。空间数据显示FIB.C2和PT.C4在第2天和第3天变得更接近，提示FIB.C2参与肾脏修复的重要作用。
• 总之，发现一个FIB.C2亚簇通过与PT.C4的细胞-细胞通讯参与肾脏修复。

Discussion

主要贡献

• 通过整合单细胞Stereo-seq与snRNA-seq，全面描绘了肾脏IRI的时空景观。
• 揭示了异质性PT亚型在细胞比例、空间分布和基因表达模式上的 distinct 动态变化。
• 识别出一个关键PT亚群——增殖性PT，作为肾脏再生的推定启动者。
• 证明p38 MAPK信号介导早期肾小管损伤，而Wnt通路在修复期间促进PT增殖。
• Acsm2（参与脂肪酸代谢的肾脏特异性基因）在增殖性PT中富集并与细胞周期进程相关。功能验证显示Acsm2缺陷小鼠表现出更严重的肾功能障碍、细胞周期进程受损和细胞增殖减少。ACSM2过表达显示细胞增殖和肾脏修复增加，揭示Acsm2在AKI中的保护作用。
• 发现FIB.C2亚簇通过与PT.C4的细胞-细胞通讯参与肾脏修复。

空间转录组技术的优势

• 空间转录组技术已成为通过实现细胞和亚细胞水平基因表达谱的原位分辨率来解剖组织再生过程的强大工具。
• 然而，基于NGS的方法受空间分辨率限制，而原位技术受低基因通量限制。
• 本研究使用Stereo-seq（高分辨率、高多重能力）克服了这些限制。

与先前研究比较

• 先前利用空间转录组学和snRNA-seq的研究已识别AKI和AKI-to-CKD转变期间的几个瞬态细胞状态，如循环、过渡、适应性（成功或不良适应修复）和退化（损伤或修复失败）。
• 本研究建立了AKI诱导的大鼠肾脏改变的综合高分辨率图谱，揭示了先前未识别的细胞转变和生态位特异性相互作用。
• 解码了Acsm2在促进损伤PT细胞向肾小管发生和功能再生中的作用。

临床意义

• 这些发现不仅加深了对AKI后内在修复机制的理解，还突出Acsm2作为促进肾脏再生和减轻不良适应修复的潜在治疗靶点。

Methods

单细胞测序、数据预处理和质量控制

• 表达少于150个基因的细胞或少于10个细胞中表达的基因移除。高质量细胞（95%最低线粒体表达比和95%最高基因计数）用于下游分析。

细胞类型鉴定和亚聚类分析

• 读段计数归一化（normalize_total），log转换。top 2000高变基因（HVGs）。PCA估计主成分，前80 PCs用于下游分析。
• Leiden聚类（分辨率0.6）。rank_genes_groups识别差异表达基因。
• 经典标记基因注释：PT（Lrp2）、LOH（Slc2a1）、DCT（Slc2a3）、IC（Atp6v1g3）、PC（Aqp2）、IMM（Ptprc）、POD（Nphs1）、Pericyte（Myh11）、FIB（Col1a2）、EC（Egfl7）。
• 靶向亚聚类分析：淋巴细胞、髓系、成纤维细胞三个最丰富的细胞类型。亚聚类分辨率0.1-1.0。

CellPhoneDB细胞-细胞相互作用分析

• CellPhoneDB（v3）探索基于显著配体-受体相互作用的细胞-细胞通讯网络。
• 矩阵结构将细胞类型对沿两轴排列，每个交叉细胞通过颜色强度梯度编码通讯强度。分层聚类算法将具有相似相互作用模式的细胞类型聚类在一起。
• 设置对称关闭生成有向热图， distinctly 表示细胞类型之间的信号方向性。

差异表达基因（DEGs）和通路富集

• Seurat FindMarkers（t检验模型）计算组间DEGs。基因过滤（avg.logFC≥0.25，p≤0.05）用于GOBP分析。
• clusterProfiler（v4.10.1）enrichGO函数进行GOBP功能富集。GSEA函数进行Reactome通路富集。fgsea模型（基因集15-500个基因），MsigDB Reactome通路。Benjamini-Hochberg校正p<0.05认为显著富集。

功能过程富集评分分析

• Seurat（v4.3.0.1）AddModuleScore函数估计目标细胞群体中每个细胞的富集评分。
• 每个评分通过计算分析基因的总基因表达并分成25个相似表达箱生成。每个目标特征基因从其对应箱中选择100个"对照"基因加入"对照"基因集。目标基因集和"对照"基因集的基因表达在每个细胞中平均生成目标评分和对照评分。细胞的目标基因集评分是目标评分和对照评分之差。

细胞轨迹分析

• PT细胞提取，slingshot（v2.10.0）推断细胞亚型间的细胞状态轨迹。slingshot在UMAP嵌入空间运行。轨迹和拟时序用ggplot2（v3.5.1）可视化。
• tradeSeq（v1.8.0）识别沿slingshot推断轨迹的基因表达模式。
• CytoTRACE（v0.3.3）预测细胞分化状态和重建发育轨迹。利用每个细胞的基因计数作为细胞可塑性的代理，假设分化程度较低的细胞以较低丰度表达更多基因。

细胞类型反卷积

• RCTD（v2.1.0）进行RNA细胞类型反卷积。scRNA-seq参考图谱从10x Genomics Chromium解离样本生成。Stereo-seq数据使用Seurat SCTransform归一化。总UMI<1000的spot过滤。反卷积在"double"模式运行允许混合细胞类型分配。

不同亚簇之间的细胞分析

• mergeCellChat比较不同样本的CellChat结果。netVisual_heatmap可视化相互作用差异（comparison参数）。通讯网络通过权重值比较（归一化缩放-100至100范围）。右侧和顶部柱状图显示每种细胞类型作为发送者（垂直轴）和接收者（水平轴）的总相互作用强度。
• CellChat circle图描述特定细胞类型之间的相互作用。线厚度定量编码通讯强度。箭头方向指定信号流方向（从免疫和成纤维细胞到PT细胞）。
• Bubble图描述FIB_C2和PT亚组之间的相互作用（约30个最高概率配体-受体对）。prob值（点颜色）代表归一化和阈值化后的通讯概率。Prob. original（点大小）表示直接从表达矩阵和配体-受体数据库计算的原始概率估计。
• Chord图描述成纤维细胞和PT细胞之间SPP1信号通路的相互作用关系。弧段长度与细胞群体大小成比例。弦代表Spp1信号通路的发生，弦颜色与启动信号的细胞类型一致。

生活很好，有你更好。