基因组 + 单细胞--KRAS^G12D靶向治疗敏感性取决于胰腺癌中干扰素信号通路的激活

作者，Evil Genius

无论发生什么，不能停止前进的脚步。

以前刚参加工作，元旦到过年的那半个月，2周多安排看30多篇单细胞文献，那时候看文献太痛苦了，我整个研究生阶段都没看几篇文献，但是为了工作，一直看，每篇都看了好几遍，最后汇报才过。

现在大家都有AI解析文献了，但是效果却远不如花费时间琢磨文献了，大家一定要在看懂原文的基础上进行总结，AI可以辅助，但绝不能依赖。

最近在写文章，可能是文献看多了的原因，用AI辅助写出来的部分读起来都是怪怪的，不太符合科研论文常用的写法。

今日参考文献,靶向药一般都针对具体的突变位点，但是现在耐药现象越来越多了，一个原因就是有了新的突变，需要新的药物治疗；但是更多的情况是微环境的改变导致的耐药，研究耐药，单细胞空间研究微环境是必需的一环。

核心问题：KRASG12D是胰腺癌的主要驱动因素，但内在耐药（intrinsic resistance）的基础尚不明确。

Graphical Abstract

研究的整体流程和机制：

1. 胰腺癌类器官生物样本库（PANCREATIC CANCER ORGANOID BIOBANK）：患者组织→肿瘤样本→类器官培养；进行RNA-seq、WGS、ATAC-seq、蛋白质组学、ChIP-seq等多组学分析。
2. 药物筛选类器官敏感性聚类模型（DRUG SCREENING-BASED ORGANOID SENSITIVITY CLUSTERING MODEL）：高通量筛选、剂量-反应曲线，将类器官分为耐药组（Resistant group） 和敏感组（Sensitive group）。
3. 联合策略的理论依据（RATIONALE FOR COMBINATION STRATEGY）：干扰素信号评分区分肿瘤表型；干扰素+KRAS抑制剂联合策略。
4. KRAS-MYC-IFN轴与靶向治疗耐药相关：

• 耐药细胞：KRASG12D→MYC入核→抑制I型干扰素信号→干扰素抑制→耐药。
• 敏感细胞：KRASG12D→MYC低→干扰素信号激活→敏感。
• MRTX1133联合干扰素可逆转耐药。

In Brief

胰腺癌中对KRASG12D靶向治疗的内在耐药由持续MYC活性相关的干扰素信号抑制驱动。激活干扰素通路（特别是通过IFN-β）可使耐药肿瘤重新敏感，并与KRAS抑制剂产生协同作用，揭示干扰素信号通路是一个可操作的靶点。

Highlights

1. 多组学分析识别出一个IFN-low亚群，该亚群对KRAS抑制具有内在耐药性。
2. 干扰素信号刺激在耐药胰腺癌模型中恢复敏感性。
3. 干扰素与KRAS抑制剂协同增强药物敏感性。
4. 持续MYC活性与IFN抑制和KRAS抑制耐药相关。

摘要总结

KRASG12D是胰腺癌的主要驱动因素，但KRASG12D靶向治疗内在耐药的基础仍不明确。

• 对242例患者来源类器官（PDOs）和匹配肿瘤组织进行整合基因组学、转录组学和蛋白质组学分析，揭示出一个KRASG12D突变亚群，对KRASG12D靶向治疗具有内在耐药性，其特征是先天免疫信号通路的显著下调。
• 功能验证表明：
  • 在敏感模型中抑制干扰素信号会诱导耐药；
  • 激活干扰素信号（特别是IFN-β）可增加耐药模型的敏感性。
• IFN-β与KRAS抑制剂（MRTX1133、HRS-4642和RMC-6236）联合在内在耐药胰腺癌中显示出协同抗肿瘤作用。
• 机制上，持续的MYC活性与KRAS抑制敏感性减弱相关，并与抑制的干扰素信号相关，提示其在促进内在耐药中的潜在作用。
• 这些发现将干扰素信号确定为KRAS靶向治疗反应的候选决定因素，并支持干扰素基础联合策略作为内在耐药胰腺癌的潜在治疗策略。

Introduction

1. 胰腺癌的临床挑战

• 胰腺癌是一种侵袭性恶性肿瘤，5年生存率约13%，全球发病率持续增加。
• 胰腺导管腺癌（PDAC）占胰腺癌的90%以上，以KRAS癌基因高频突变为特征，约90%病例携带KRAS改变。
• 实验模型显示，KRAS基因消融可诱导细胞周期停滞、凋亡、肿瘤消退和通过多种机制激活免疫。此外，致癌KRAS信号通过促进关键免疫抑制细胞的招募和极化，在免疫抑制微环境中发挥关键作用。

2. KRAS靶向治疗的进展与挑战

• 尽管KRAS数十年来被认为是"不可成药"的，最近已成为治疗靶点。KRASG12C抑制剂sotorasib的突破性批准推动了其他KRAS抑制剂的开发。
• KRASG12D突变约占胰腺癌病例的40%，凸显KRASG12D特异性抑制剂的临床重要性。
• 然而，内在耐药限制了KRASG12D靶向治疗的疗效，其机制尚不清楚。

3. 干扰素信号与肿瘤免疫

• 干扰素信号在抗肿瘤免疫中发挥关键作用，但其在KRAS靶向治疗耐药中的作用尚不明确。
• 本研究旨在通过多组学分析揭示KRASG12D靶向治疗内在耐药的机制，并探索干扰素信号作为潜在治疗靶点。

4. 研究目标

• 整合WGS、bulk RNA-seq、ATAC-seq、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学（来自类器官），以及snRNA-seq（来自人类肿瘤组织样本）分析KRASG12D突变胰腺癌。
• 识别与耐药相关的分子特征，特别是先天免疫信号抑制。
• 验证干扰素信号激活（特别是IFN-β）是否可恢复耐药模型的敏感性，并与KRAS抑制剂协同。
• 探究MYC活性在干扰素信号抑制和内在耐药中的作用。

Results

结果1、KRASG12D突变胰腺癌类器官的基因组图谱

多组学分析：

• 对KRASG12D突变胰腺癌进行多组学分析，整合WGS、bulk RNA-seq、ATAC-seq、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学（来自类器官），以及snRNA-seq（来自人类肿瘤组织样本）。
• 单核苷酸变异（SNVs）、深度缺失、扩增和融合分析显示，两组之间主要驱动基因（KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4）频率相当，ARID1A、MYC和APOBEC3B改变相似，个体类器官中罕见融合（如NUP98-CDK1C和AXIN1-LMF1）。两组之间未观察到癌症相关基因组改变的显著差异。

KRAS下游信号相关基因的差异：

• 耐药类器官相对富集MAPK通路改变（FGFR3、RAS4A、RAF1、MAP2K1和MAPK1）。
• 敏感类器官富集PI3K-AKT和RALA-RALB轴基因（RALBP1、ARF6、EXOC2和RAC3）。
• 先天免疫相关基因的扩增（MHC I类分子和S100钙结合蛋白家族）在耐药组中频率低于敏感组。

克隆选择评估：

• 用MRTX1133处理三个耐药PDOs 5天，进行全外显子测序。高频突变和VAF保持稳定，CCF分析未检测到 emergent 克隆，表明耐药并非源于明显的遗传克隆选择。

结果2、与KRASG12D靶向治疗耐药相关的转录组改变

GSEA分析：

• 对耐药和敏感KRASG12D类器官的转录组和蛋白质组数据进行GSEA。
• RNA水平：耐药组上调KRAS Signaling Dn、上皮-间充质转化（EMT）和异源物质代谢，同时下调先天免疫信号通路，包括IFN-α和IFN-γ反应、TNF-α信号通过NF-κB通路和炎症反应。
• 蛋白质组学：证实耐药组中免疫信号通路显著抑制（除TNF-α信号通过NF-κB外）。
• ATAC-seq：耐药类器官中上调基因的染色质可及性增加，下调基因的可及性降低。
• 磷酸化蛋白质组学：免疫相关磷酸蛋白（CD47、TGFB1I1和SIGIRR）水平降低。

结果3、先天免疫信号作为治疗耐药的关键贡献者

snRNA-seq验证：

• 对来自10例耐药和13例敏感患者的23个肿瘤组织进行snRNA-seq，获得170,309个高质量细胞核。
• 注释为13个聚类，代表恶性细胞、导管细胞、腺泡细胞、内皮细胞、内分泌细胞、施旺细胞、周细胞、CAFs、肥大细胞、浆细胞、B细胞、T细胞和髓系细胞。
• 耐药肿瘤的恶性和CAF细胞比例较低，但腺泡和T细胞比例高于敏感肿瘤。

恶性上皮细胞分析：

• 无监督聚类未能将耐药和敏感组的恶性细胞分成离散聚类，表明整体转录状态相似。
• 然而，GSEA显示耐药肿瘤的恶性细胞富集KRAS Signaling Dn，并表现出IFN-α和IFN-γ反应信号通路降低。
• 值得注意的是，耐药组中所有细胞类型都表现出较低的干扰素信号，其中恶性细胞和导管细胞中干扰素信号下调最明显。

结果4、干扰素信号与KRAS靶向治疗的特定协同相互作用

ssGSEA分析：

• 对模式识别受体（PRRs）和干扰素相关通路进行ssGSEA，耐药组先天免疫信号通路评分显著降低。

联合治疗筛选：

• 在敏感类器官中，MRTX1133与各种先天免疫激活剂联合未显著增强效果。
• 在耐药类器官中，IFN-β + MRTX1133和IFN-γ + MRTX1133显著降低细胞活力。
• IFN-β联合其他KRAS抑制剂（HRS-4642和RMC-6236）显示中度协同作用，但与5-FU或吉西他滨联合效果甚微。
• 四种互补分析模型（Bliss、ZIP、HSA、Loewe）均表明细胞因子与MRTX1133之间存在协同相互作用，而非非特异性毒性，其中IFN-β与MRTX1133的联合效果最强。

结果5、干扰素信号激活改善对KRASG12D靶向治疗的敏感性

体外功能验证：

• 在耐药类器官系中，IFN-β或MRTX1133单独减少类器官大小和数量，而联合治疗比任一单药显著更强地抑制增殖。
• PI染色确认IFN-β单独具有中度细胞毒性，但联合治疗显著增加肿瘤细胞致死性。

IFNAR1敲低验证特异性：

• 生成6个IFNAR1敲低类器官，三种shRNAs有效抑制IFNAR1转录水平。
• 在这些细胞系中，IFN-β处理未能诱导下游基因表达，联合敏感性显著降低。
• 体内，IFNAR1敲低不影响肿瘤生长，免疫荧光确认有效敲低，Ki-67或CC3阳性无变化，表明IFNAR1缺失不影响体内增殖或凋亡。此外，IFNAR1敲低减弱了IFN-β和MRTX1133联合治疗的反应。

JAK-STAT通路验证：

• 用JAK-STAT通路抑制剂（ruxolitinib）单独或与MRTX1133联合处理耐药类器官。ruxolitinib单药效果甚微，但进一步降低了对MRTX1133的反应。
• 敲低STAT1或STAT2（JAK-STAT通路下游代表组分）在四个耐药类器官系中均增加对MRTX1133的耐药性。
• 这些结果支持IFNAR1-JAK-STAT轴参与KRAS抑制的内在耐药，并确定其为潜在治疗靶点。

结果6、持续MYC活性与减弱干扰素信号相关，与内在耐药相关

MRTX1133处理后的转录组分析：

• 用MRTX1133处理13个PDO系（6个内在耐药和7个敏感）2天，进行bulk RNA-seq。
• 两组中，MRTX1133处理均诱导KRAS Signaling Dn、IFN-α和IFN-γ信号通路上调，KRAS Signaling Up和EMT下调。
• 然而，耐药组中干扰素相关信号下调更明显，而MYC相关信号通路（包括MYC targets V1和V2、MYC active pathway）显著富集。
• MYC表达和核定位在耐药类器官中也更高。

ChIP分析：

• MRTX1133处理后，耐药类器官中MYC结合峰更强、更丰富，表明MYC转录活性更高。
• 与敏感类器官相比，耐药类器官中MYC对干扰素、JAK-STAT和PRR相关信号基因的结合活性增强。
• 耐药类器官中MRTX1133处理后几个先天免疫基因表达降低。

MYC功能验证：

• 在耐药（DAC-144）和敏感（DAC-224）类器官中进行MYC过表达和敲低实验。
• MYC过表达抑制免疫反应相关基因和多个下游ISGs表达。
• MYC敲低则产生相反效果。
• MYC过表达在敏感类器官（DAC-224）中诱导显著耐药，但在内在耐药类器官（DAC-144）中未进一步增加耐药性。
• 相反，MYC敲低在耐药类器官（DAC-144）中增加对MRTX1133的敏感性，但在敏感类器官（DAC-224）中无显著效果。

总结：在耐药类器官中，KRASG12D抑制对MYC活性的抑制效果较差，这与先天免疫信号减弱同时发生，可能促进治疗耐药。

结果7、MRTX1133和IFN-β联合增强体内治疗敏感性

PDX模型验证：

• 检查3个KRASG12D耐药、3个KRASG12D敏感和2个KRASG12V突变PDX模型，在四种治疗条件下。
• IFN-β单药对KRASG12D耐药PDXs的肿瘤生长影响甚微，而MRTX1133在KRASG12D敏感PDXs中显示更大活性。
• 值得注意的是，MRTX1133 + IFN-β显著降低KRASG12D耐药PDXs的终点肿瘤体积。
• 在DAC-178类器官衍生异种移植模型中，IFN-β和IFN-γ与MRTX1133联合均有效减少肿瘤生长。

机制验证：

• 分析DAC-144肿瘤在四种治疗条件下的终点样本，进行IF染色（Ki-67、CC3、IRF9）。
• IFN-β（单独或联合）激活干扰素信号（核IRF9+肿瘤细胞）。MRTX1133单独也增加IRF9+肿瘤细胞。
• 所有治疗均降低Ki-67阳性，联合组最低。相反，CC3阳性在所有三个治疗组中显著增加。

scRNA-seq验证：

• 对DAC-137异种移植进行scRNA-seq。仅联合组表现出相对于vehicle或MRTX1133治疗的KRAS Signaling Dn特征显著增加。
• 免疫相关通路（包括IFN-α反应和JAK-STAT信号）在所有治疗组中升高。
• 这些结果确认干扰素通路激活在体外和体内改善对KRASG12D靶向治疗的敏感性。

结果8、先天免疫信号在KRASG12D抑制的获得性耐药中被抑制

体外获得性耐药模型：

• DAC-67类器官在53天内暴露于逐渐增加的MRTX1133浓度，产生稳定耐药。
• 对敏感和耐药时间点进行bulk RNA-seq。与内在耐药类似，适应性耐药DAC-67类器官显示先天免疫通路显著下调（I型和II型干扰素反应、TNF-α和NF-κB信号、IL-6-JAK-STAT3信号）。耐药衍生株也表现出MYC active pathway上调和MYC repressed pathway下调，表明MYC活性增强。

体内获得性耐药模型：

• 在C57BL/6小鼠中建立获得性耐药KPC模型，在治疗反应期（2周）和再生长阶段（1.5个月）收集样本进行scRNA-seq。
• 肿瘤细胞再聚类揭示三个亚簇：亚簇0稳定，亚簇1减少，亚簇2在耐药获得过程中扩张。
• 通路富集显示：
  • 亚簇0富集DNA修复和增殖通路；
  • 亚簇1和2均富集MYC相关通路；
  • 亚簇1还富集先天免疫通路，包括干扰素反应。

总结：尽管时间和细胞背景不同，内在和获得性耐药中干扰素相关通路的汇聚表明，共享的免疫逃逸机制可能是KRASG12D靶向治疗跨治疗阶段耐药的基础。

讨论

主要贡献

• 本研究揭示了胰腺癌中对KRASG12D靶向治疗内在耐药的机制，其中干扰素信号抑制介导耐药并与持续MYC活性相关。
• 整合PDOs和患者肿瘤组织的多组学数据，显示一部分KRASG12D突变胰腺癌通过抑制先天免疫信号通路（特别是干扰素信号）对KRASG12D靶向治疗产生内在耐药。
• 功能验证表明，激活干扰素信号（特别是IFN-β）可恢复耐药模型的敏感性，并与KRAS抑制剂协同。
• 机制上，耐药类器官中MYC活性受MRTX1133抑制效果较差，MYC对干扰素、JAK-STAT和PRR相关基因的结合增强，抑制其表达，导致免疫逃逸和耐药。

临床意义

• 这些发现将干扰素信号确定为KRAS靶向治疗反应的候选决定因素。
• 支持干扰素基础联合策略（特别是IFN-β + KRAS抑制剂）作为内在耐药胰腺癌的潜在治疗策略。
• MYC活性可能作为预测KRAS靶向治疗反应的生物标志物。

局限性

• 需要进一步研究干扰素信号与KRAS抑制剂联合治疗的安全性和有效性。
• 未来需要对来自不同反应患者的临床样本进行多组学分析，以定义与治疗反应相关的肿瘤内在特征。

结论

• 本研究揭示了KRASG12D靶向治疗内在耐药的新机制，并提出了IFN-β联合KRAS抑制剂作为潜在治疗策略。
• MYC-IFN轴可能成为胰腺癌治疗的重要靶点。

分析方法

体细胞突变调用和注释

• GATK最佳实践流程。Trimmomatic质控，BWA-mem比对hg19，Samtools转换BAM，Picard标记重复，GATK碱基质量重校准。
• Mutect2调用体细胞变异，ANNOVAR注释。VAF < 0.05的变异排除。COSMIC和OncoKB数据库识别癌症相关基因。

拷贝数分析

• CNVkit识别体细胞CNVs，GISTIC2.0确定显著复发性拷贝数改变。Gene-level CNV事件基于GISTIC2.0输出阈值分类。

肿瘤突变负荷（TMB）

• TMB计算为非 synonymous体细胞突变数/编码区兆碱基。总突变数除以编码序列大小（~35 Mb）。

基因融合检测

• STAR-Fusion识别RNA-seq数据中的基因融合事件。

SnRNA-seq数据预处理

• 低质量细胞过滤（<200基因或>3,000基因，<1,000基因计数和>10%线粒体reads）。
• Seurat归一化和预处理。Harmony校正批次效应。UMAP降维。经典标记注释细胞类型。肿瘤细胞亚聚类分辨率0.2。clusterProfiler GSEA。GSVA ssGSEA计算干扰素相关特征评分。

ScRNA-seq数据预处理

• Seurat归一化和预处理。FastMNN校正批次效应。UMAP降维。经典标记注释细胞类型。肿瘤细胞亚聚类分辨率0.2。FindAllMarkers识别差异表达基因。clusterProfiler GSEA。

生活很好，有你更好。