文献分享（xenium 5k）--单细胞与空间多组学揭示多药耐药中肿瘤-基质界面的复发性多细胞生态位

作者，Evil Genius

今天我们分享文献

摘要

多药耐药（MDR）是癌症治疗几乎不可避免的终点，驱动肿瘤快速进展，然而其演化逻辑仍不清楚，因为MDR肿瘤很少被切除。本研究利用来自临床试验的配对初治和MDR黑色素瘤标本，整合单细胞和空间多组学，并与来自10种其他癌症类型的数据集联合评估，识别出一个复发性MDR相关空间生态位，位于肿瘤-基质界面。该生态位将CXCL14⁺炎性癌症相关成纤维细胞（iCAFs）、TREM2⁺肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和AXL⁺去分化肿瘤细胞并列，并伴随肿瘤反应性CXCL13⁺CD8⁺T细胞的丢失。体外实验中，CXCL14促进巨噬细胞迁移和TREM2诱导，而TREM2⁺TAMs通过CD86-CTLA4信号抑制CXCL13⁺CD8⁺T细胞。TREM2⁺TAMs还通过油酸驱动的GAS6-AXL激活促进肿瘤去分化。研究团队开发了一种靶向FAP/TREM2的双特异性抗体，以破坏该空间生态位并恢复MDR患者来源异种移植模型的治疗敏感性，且安全性良好。

引言

MDR的临床挑战

• 免疫治疗、靶向治疗和化疗彻底改变了癌症治疗范式。然而，耐药挑战限制了长期获益，MDR成为几乎不可避免的临床结局。
• MDR在临床肿瘤学中被定义为对多种具有不同化学结构和作用机制的治疗药物获得耐药的能力，涵盖化疗、靶向治疗和免疫治疗。
• 在这种背景下，MDR代表一个复杂的演化状态，肿瘤细胞可塑性进展性地逃逸细胞毒性、信号阻断和免疫监视。
• 进入MDR状态的患者经历肿瘤负荷快速增加、生活质量显著下降和预后明显不良。

空间多组学的机遇

• 空间多组学的出现彻底改变了肿瘤学研究范式。
• 在耐药领域，新兴证据阐明了几个关键机制，包括T细胞的进行性功能耗竭、基质屏障诱导的细胞毒性CD8⁺T细胞浸润排除，以及肿瘤细胞的动态表型重编程。
• 先前的研究主要局限于单药治疗策略。由于大多数MDR患者缺乏手术指征（通常处于晚期），伦理限制阻碍了相关临床样本的收集，显著限制了对驱动MDR发展的演化轨迹和分子机制的全面研究。

核心未解问题

• MDR领域另一个关键未解问题是：癌症中MDR的演化轨迹是否在不同癌症类型间遵循某种保守范式，还是表现出癌症类型特异性，这从根本上决定了广泛适用的MDR再致敏策略的可行性。

研究设计

• 研究团队先前进行了一项临床试验（ChiCTR 2000035782），使得能够收集配对的初治和MDR恶性黑色素瘤（MM）样本。
• 利用整合的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间多组学，表征了这些样本的肿瘤微环境（TME）和代谢表型，并使用来自10种其他癌症类型的数据检查了相关特征。
• 识别出一个复发性MDR相关空间生态位，包括CXCL14⁺iCAFs、TREM2⁺TAMs和AXL⁺去分化肿瘤细胞。
• 该生态位具有激活的油酸（OA）代谢和涉及STAT1/STAT6转录因子平衡的调控机制，共同在生物学和物理水平上实现对抗癌药物诱导的细胞毒性的抵抗。
• 最终，研究团队工程化了一种靶向FAP和TREM2的双特异性CAF-TAM抗体（BCTA），并证明其能够有效再致敏MDR，同时保持良好安全性。

结果部分 1：MDR中髓系细胞和CAFs优先共富集于肿瘤-基质界面

临床队列构建

• 对在本机构治疗的MM患者进行纵向随访。
• 所有患者在入院前均为初治，最初接受手术切除，收集肿瘤标本用于病理诊断和作为初治样本。
• 手术后，初始放射学疾病控制随后在暴露于至少两种具有不同机制的全身治疗类别/方案后进展的患者被认为是临床MDR，并被纳入研究团队领导的前瞻性、单臂、1期临床试验，研究高记忆表型肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）联合toripalimab治疗晚期MM。
• 淋巴结转移、途中转移和复发性肿瘤病灶被手术切除，一部分用于TIL制备，其余保存为MDR样本。
• 使用这些方法，组装了一个配对的初治和MDR MM标本临床队列。

发现队列与验证队列

• 使用初治和MDR MM样本作为发现队列，泛癌耐药数据集和临床注释的MDR样本作为验证队列。
• 长期随访后，8个MDR样本（包括5个配对初治MM样本）被纳入scRNA-seq队列。
• 严格数据质量控制后，保留61,824个细胞用于下游分析，基于经典标记基因注释为10种细胞类型。
• MM细胞的注释使用拷贝数变异（CNV）评分确认。
• B、髓系和浆细胞的比例在MDR组中升高，但差异无统计学意义。
• 为了确保精确的细胞身份，进一步对免疫和基质谱系进行精细聚类，并通过 distinct 经典标记物的表达验证。
• 为了从空间角度解码MDR的TME，将先前研究的5个初治样本和本研究生成的4个MDR MM样本纳入Visium空间转录组学（ST）队列。
• 基于单细胞数据的标记基因面板可视化10种细胞类型的空间分布。
• 值得注意的是，在MDR组中，髓系细胞和CAFs分布在肿瘤-基质界面，显示显著的空间共富集。相比之下，这种现象在初治组中不那么明显。

肿瘤-基质界面的意义

• 肿瘤-基质界面是肿瘤细胞侵入周围非肿瘤组织并与其他细胞类型建立直接接触的区域。
• 它作为前线，肿瘤细胞在此对抗癌治疗产生抵抗。该区域通常以强免疫抑制特征和广泛的代谢重编程为特征。
• 髓系细胞和CAFs在肿瘤-基质界面的空间共富集随后得到另外四种癌症类型的Visium数据的支持。
• 来自MDR样本的八种癌症类型的多重免疫组化（mIHC）图像进一步支持了这一发现。

小结

• 从单细胞和空间角度分析了初治和MDR MM的TME，揭示髓系细胞和CAFs在MDR中空间共富集于肿瘤-基质界面。
• 这种空间共富集模式也在评估的癌症数据集和样本中观察到，突出其与MDR的潜在相关性。

结果部分 2：界面富集的TREM2⁺TAMs在MDR中显示免疫抑制性脂质代谢程序

免疫景观分析

• 为了机制性地剖析空间生态位，优先表征免疫景观，特别是髓系组分。
• 识别出总共22种细胞亚型。TREM2⁺TAMs被发现显著富集于MDR组，并在泛癌单细胞数据集中一致验证。
• 通过mIHC和流式细胞术进一步验证这一发现，分层分析显示在评估的解剖部位、遗传背景和治疗史亚组中一致富集。
• 一致地，在MM免疫治疗队列中，TREM2⁺TAMs的比例在无应答组中显著高于应答组，免疫治疗提高了TREM2⁺TAMs的浸润。
• 整合轨迹推断分析一致提示从SPP1⁺TAMs到TREM2⁺TAMs的潜在分化转变，与两个亚群中观察到的M2样特征一致。

空间分布

• 在空间上，TREM2⁺TAMs特异性分布在肿瘤-基质界面，这是非肿瘤和肿瘤细胞之间交叉对话的主要区域，在MDR MM组中。
• 这一发现也在泛癌耐药样本中观察到。

脂质代谢表型

• 在TREM2⁺TAMs中观察到激活的脂质代谢通路和脂质代谢相关基因（APOE、LIPA和APOC1）的高表达，突出其激活的脂质代谢表型。
• 为了确定这种代谢特征是否决定特定细胞状态，进行定量评分，揭示高脂质代谢与TREM2⁺TAMs中的M2极化耦合。
• 与这种免疫抑制代谢状态不同，非TREM2⁺群体表现出相对富集的促炎和免疫监视通路。

空间代谢组学验证

• 为了在组织水平验证这种代谢谱，选择Visium队列中的六个样本（三个初治和三个MDR）进行气流辅助解吸电喷雾电离质谱（AFADESI-MS）成像空间代谢组学（SM）。
• 总共检测到2,656个质荷比（m/z）。
• KEGG代谢数据库显示最可识别的m/z值与代谢密切相关，根据人类代谢组数据库（HMDB），13.93%是脂肪酸。
• 基于H&E和ST图像，每个样本分为肿瘤和瘤旁区域。在初治和MDR组之间观察到肿瘤和瘤旁区域的 distinct 代谢模式，而同一组内同一区域的代谢模式保持一致。
• 由于TREM2⁺TAMs分布在肿瘤区域周围，进一步表征两组之间瘤旁区域的代谢模式差异，发现差异代谢物富集在脂质代谢通路中。
• 代表性MS图像显示MDR组瘤旁区域脂质代谢物的富集，进一步强调TREM2⁺TAMs的脂质代谢表型。
• MDR MM的mIHC染色支持TREM2⁺TAMs在肿瘤-基质界面的特异性定位，这种空间模式在多种癌症类型的MDR样本中一致观察到。
• TREM2过表达（TREM2-OE）TAMs的转录组 profiling 进一步支持这些机制联系，显示TREM2诱导促进M2样极化并上调关键脂质代谢基因，重现单细胞特征。
• 这些数据表明特定的脂质代谢特征不仅是表型特征，而且与TREM2⁺TAMs的免疫抑制状态密切相关。

小结

• 总之，数据表明界面富集的TREM2⁺TAM状态，以升高的脂质代谢和免疫抑制特征为特征，在MDR MM中扩展。
• 这种 distinct 的空间-代谢模式也在多种癌症类型中观察到，暗示其作为MDR潜在贡献者的作用。

结果部分 3：TREM2⁺TAMs通过CD86-CTLA4检查点轴抑制CXCL13⁺CD8⁺T细胞区室

CXCL13⁺CD8⁺T细胞减少

• 先前研究已暗示TREM2⁺TAMs在塑造免疫抑制微环境和CD8⁺T细胞功能障碍中的作用。
• 注意到CXCL13⁺CD8⁺T细胞的比例在MDR组中显著减少，这在泛癌scRNA-seq和MM bulk-seq免疫治疗队列中得到进一步验证。
• 最近研究表明CXCL13⁺CD8⁺T细胞是肿瘤反应性的，与三级淋巴结构形成和有利的免疫治疗反应相关。
• 发现CXCL13⁺CD8⁺T细胞显示干性富集的程序，高表达多种抑制性受体，突出CXCL13表达。
• 值得注意的是，这种干性富集与抗原经验、肿瘤反应性表型相容，可能代表一个可以被免疫治疗重新激活的池。

TREM2⁺TAMs与CXCL13⁺CD8⁺T细胞的负相关

• 接下来，询问MDR肿瘤中TREM2⁺TAMs的增加是否可能导致CXCL13⁺CD8⁺T细胞区室的减少和功能衰减，从而可能导致免疫治疗耐药。
• TREM2⁺TAMs和CXCL13⁺CD8⁺T细胞的浸润水平在跨癌症的单细胞水平上显著负相关，这进一步得到mIHC绝对细胞密度定量和流式细胞术的支持。
• 空间上，TREM2⁺TAMs和CXCL13⁺CD8⁺T细胞表现出 distinct 的分布模式。

细胞-细胞通讯分析

• 细胞-细胞通讯分析揭示TREM2⁺TAMs与CD8⁺T细胞强烈相互作用，特别是CXCL13⁺CD8⁺T细胞。
• 通路水平筛选重现了MHC-I信号作为排名最高的相互作用，与TREM2⁺TAMs的抗原呈递性质一致。
• 值得注意的是，CD86信号也成为排名最高的免疫调节候选者，并因其通过CTLA4/CD28竞争已建立的检查点功能而被优先考虑。
• CD86通路的功能表征揭示CD86-CTLA4配体-受体对是TREM2⁺TAMs和CXCL13⁺CD8⁺T细胞之间预测相互作用的主导。

共培养验证

• CTLA4是经典免疫检查点，竞争性结合CD80或CD86与抗原呈递细胞上的CD28，从而向T细胞传递抑制信号并阻止其激活和效应功能。
• 最终，使用TREM2-OE TAM共培养系统验证，显示TREM2-OE TAMs上调CD86并减少CXCL13⁺CD8⁺T细胞的丰度并抑制其细胞毒性（GZMB）和增殖（Ki67）程序，同时增加PD1表达。
• 重要的是，这些表型被CTLA4阻断显著逆转，强调CD86-CTLA4轴在这些调节中的关键作用。
• 总之，这些数据表明TREM2⁺TAMs可能通过CD86-CTLA4信号在这种短期共培养系统中减少CXCL13⁺CD8⁺T细胞区室的丰度并改变其功能标记谱。

结果部分 4：AXL驱动的EMT和干性在去分化亚群中促进MDR

肿瘤细胞亚群鉴定

• 然而，TREM2⁺TAM介导的CD8⁺T细胞功能障碍不能完全解释非免疫治疗药物的耐药。
• 免疫抑制细胞可以驱动肿瘤细胞表型重塑，通过细胞因子分泌导致恶性生物学行为。
• 因此，对肿瘤细胞进行了深入分析。基于基因谱和功能特征，将发现队列中的肿瘤细胞分为五个 distinct 亚群：黑色素生成、免疫调节、细胞外基质相关（ECM相关）、去分化和神经细胞样。
• 黑色素生成亚群以黑色素生成相关基因上调为特征，如MITF、SOX10、PMEL和TYRP1；免疫调节亚群显示HLA家族基因和趋化因子如CCL5的高表达；ECM相关亚群以MMP和胶原家族蛋白上调为标志；去分化亚群显示干性相关基因如AXL、CD34和ALDH2表达增加；神经细胞样亚群以神经嵴标记物如NGFR、EGFR和ERBB3上调为特征。
• 在肿瘤细胞亚群中观察到进行性分化，最终末状态在黑色素生成亚群中观察到，初始阶段在去分化亚群中。
• 功能分析进一步证实这些表型，识别出“色素积累”、“参与免疫反应的T细胞分化”、“细胞外基质细胞信号”、“上皮-间充质转化（EMT）”和“神经嵴干细胞”通路分别在黑色素生成、免疫调节、ECM相关、去分化和神经细胞样亚群中富集。
• 计算了注释与来自四个独立队列的先前定义的小鼠和人类MM肿瘤细胞亚群的相关性。
• 研究中的一些亚群与已发表的亚群显示强一致性，包括Tsoi等人描述的去分化和未分化状态。
• 去分化亚群在MDR组中显示最显著的上调，这与先前研究一致。
• 空间上，观察到去分化亚群优先定位于肿瘤-基质界面，而其他四个亚群从肿瘤核心到瘤旁区域的分布似乎不遵循特定模式。

去分化亚群的功能

• 去分化亚群的浸润水平和空间定位提示其在MDR中的潜在作用，促使进一步研究。
• 功能上，EMT和干细胞相关通路在去分化亚群中高度富集，高去分化评分的患者表现出不良预后。
• 在抗肿瘤药物治疗下，肿瘤细胞经历EMT和干性转变，增强其对药物攻击的抵抗力。这可能解释MDR的发展；然而，调控去分化亚群的关键基因仍不确定。
• 观察到去分化亚群中AXL显著上调。
• 此外，跨癌症的单细胞数据显示AXL⁺肿瘤细胞的比例在无应答组中呈上升趋势。
• 空间上，AXL表达优先定位于肿瘤周边，与去分化亚群的分布一致。
• AXL是受体酪氨酸激酶家族的成员，通过配体结合或自身过表达进行同源二聚化。
• 提出AXL是介导去分化亚群EMT和干性相关特征的调控因子。

AXL功能验证

• 因此，在A375（人）和B16（小鼠）MM细胞系中过表达AXL。
• 由于A375细胞只能植入免疫缺陷BALB/c-nu小鼠，而B16细胞缺乏BRAF突变，使用A375细胞评估靶向治疗耐药，使用B16细胞评估免疫治疗耐药。
• A375-AXL细胞在体外部分抵抗靶向治疗的肿瘤杀伤效应。
• 接下来，AXL过表达导致癌细胞中E-钙粘蛋白下调和N-钙粘蛋白、波形蛋白和CD44上调。
• AXL过表达在体内降低了对免疫治疗和靶向治疗的敏感性，表现为更大的肿瘤体积和更差的预后。

结果部分 5：TREM2⁺TAMs调控AXL⁺去分化肿瘤细胞

TREM2敲除实验

• 为了研究TREM2⁺TAMs对AXL⁺去分化肿瘤细胞的调控作用，在野生型和TREM2-/-小鼠中建立了B16细胞皮下肿瘤模型。
• 结果显示TREM2缺失显著抑制肿瘤生长。

GAS6-AXL轴

• TREM2⁺TAMs通过油酸驱动的GAS6-AXL激活促进肿瘤去分化。
• GAS6是AXL的配体，由TREM2⁺TAMs分泌。
• 油酸代谢激活TREM2⁺TAMs中GAS6的表达和分泌。
• GAS6与AXL结合激活下游信号通路，促进肿瘤细胞EMT和干性。

结果部分 6：CXCL14促进巨噬细胞迁移和TREM2相关特征

CXCL14⁺iCAFs的鉴定

• CXCL14⁺iCAFs在MDR组中显著富集，这在mIHC中得到进一步验证，在分层分析中显示一致富集。
• 在独立的单细胞BCC数据中观察到类似现象，促使进一步研究CXCL14⁺iCAFs。
• 功能上，巨噬细胞迁移、髓系细胞分化、免疫反应和炎症反应通路在CXCL14⁺iCAFs中富集。
• 镜像TREM2⁺TAMs中观察到的趋势，CXCL14⁺iCAFs的浸润在免疫治疗无应答组中升高，免疫治疗进一步增强瘤内CXCL14⁺iCAF浸润。
• TREM2⁺TAMs和CXCL14⁺iCAFs的浸润水平在单细胞水平上跨癌症强正相关，并共享相似的空间分布模式。

CXCL14的功能

• 基于这些发现，假设CXCL14信号可能通过CXCR4依赖性调节STAT1/STAT6活性促进巨噬细胞迁移和TREM2相关特征的诱导。
• 补充rhCXCL14以剂量依赖性方式增加THP1细胞招募。
• CXCR4是CXCL14的推定受体，在多种细胞类型表面丰富表达，特别是巨噬细胞。
• rhCXCL14对THP1细胞的招募被CXCR4抑制剂AMD3100消除。
• 总之，这些体外数据表明CXCL14促进PMA诱导的THP1细胞通过CXCR4依赖性机制的迁移。

TREM2诱导

• 进一步观察到用rhCXCL14处理的THP1细胞表现出增强的脂滴积累和升高的TREM2表达，表明CXCL14能够在体外将TAMs的表型推向TREM2⁺状态。
• 先前结果表明STAT6磷酸化在TREM2⁺TAMs中增加，而STAT1磷酸化降低。
• 补充rhCXCL14增强STAT6磷酸化并降低STAT1磷酸化；然而，这些效应被CXCR4抑制剂逆转。
• 利用JASPAR数据库，识别出三个潜在的STAT1和STAT6在TREM2启动子区域的结合位点。
• 染色质免疫沉淀定量PCR分析验证STAT1和STAT6均特异性结合到TREM2启动子上的三个预测结合位点。
• 双荧光素酶报告基因测定验证STAT6增强，而STAT1降低TREM2转录。
• 总之，这些发现表明CXCL14通过CXCR4依赖性调节STAT1/STAT6活性在体外促进巨噬细胞迁移并诱导TREM2相关特征。
• 结合CXCL14⁺iCAFs和TREM2⁺TAMs之间的空间关联，这些数据支持潜在的上下游生态位模型，而无需在体内建立直接的iCAF介导的招募或重编程。

结果部分 7：Xenium profiling解析与MDR相关的复发性空间生态位

Xenium分析

• 虽然Visium提供斑点水平见解，但进行Xenium profiling以解析MDR肿瘤中空间生态位的精细架构。
• 值得注意的是，CXCL14未包含在Xenium 5K面板中，而CXCL12在scRNA-seq数据中与CXCL14在iCAF状态中共表达。
• 分析CXCL12⁺CAFs作为Xenium可测量的iCAF相关基质区室。
• 遵循主要谱系鉴定，空间信息表型鉴定策略揭示AXL⁺肿瘤细胞、TREM2⁺TAMs和CXCL12⁺CAFs在MDR中特异性共聚集到高度复发的生态位，沿肿瘤-基质界面形成空间生态位，但在初治MM中不形成。
• 独立地，无监督细胞邻域（CN）分析识别出两个相邻的界面邻域，CN1（界面肿瘤）和CN2（界面基质），物理 delineate 这些空间生态位的复发生态位。
• 为了确保稳健和无偏定量，使用严格的原始转录本计数定义AXL⁺/⁻肿瘤细胞、TREM2⁺/⁻TAMs和CXCL12⁺/⁻CAFs，并量化组合的CN1/CN2生态位。这支持AXL⁺肿瘤细胞、TREM2⁺TAMs和CXCL12⁺CAFs相对于标记阴性对应物的特异性富集。
• 该空间生态位在MDR HCC中使用相同分析得到验证。
• MM和HCC中的定量分析进一步揭示，虽然初治MM中的CXCL12⁺CAFs（而非AXL⁺肿瘤细胞）显示基线优先邻近TREM2⁺TAMs，但MDR肿瘤演化出空间压缩，其中AXL⁺肿瘤细胞和CXCL12⁺CAFs均汇聚于TREM2⁺TAM枢纽，物理距离显著短于其标记阴性对应物。
• 最后，使用Xenium profiling对额外MDR样本的验证，辅以mIHC和H&E可视化，进一步支持该空间生态位的一致复发。
• 总之，这些高分辨率空间分析，得到组织病理学证据的支持，突出空间生态位作为与MDR相关的特征。

结果部分 8：BCTA再致敏跨癌症的MDR

临床相关性验证

• 基于对MDR潜在机制的理解，另一个关键挑战是确定如何再致敏癌症中的MDR。
• 为此，首先在四个临床队列中验证上述关键细胞群体的浸润水平和临床相关性。
• TREM2⁺TAMs显示与AXL⁺肿瘤细胞和CXCL14⁺iCAFs的浸润正相关，而在MM、HCC、NSCLC和cCRC TMA队列中与CXCL13⁺CD8⁺T细胞负相关。
• Cox回归分析支持TREM2⁺TAMs、AXL⁺肿瘤细胞和CXCL14⁺iCAFs与不良预后相关，而CXCL13⁺CD8⁺T细胞与MM和HCC队列中的有利临床结局相关。
• TREM2⁺TAMs和CXCL14⁺iCAFs还与NSCLC和cCRC队列中的晚期临床阶段相关。
• 这些发现提示靶向TREM2⁺TAMs可能是逆转癌症MDR的潜在治疗策略。

双特异性抗体设计

• 先前临床研究表明，尽管TREM2单克隆抗体（mAbs）在血浆中达到足够的全身浓度，但未能特异性耗竭肿瘤组织内的TREM2⁺TAMs。
• 提出有限的治疗反应可能归因于TREM2 mAb在TME内渗透和积累不足。
• 为了解决这个问题，设计了一种能够同时靶向CXCL14⁺iCAFs和TREM2⁺TAMs的双特异性抗体。
• 鉴于FAP在肿瘤基质内CAFs中的高特异性表达，将FAP mAb的单链可变片段（scFv）结构偶联到TREM2 mAb，并在FUT8-CHO细胞中表达BCTA以增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）效应。
• BCTA被工程化和纯化为均一分子，保留了两个组成抗体的预期结合特异性。
• 验证BCTA介导剂量依赖性ADCC，特异性裂解CAFs和TREM2-OE TAMs。

体内疗效

• 为了探索BCTA在体内的疗效，使用人类造血干细胞（huHSC）小鼠建立了MM和HCC的MDR患者来源肿瘤异种移植（PDX）模型。
• 发现BCTA显著再致敏MM对免疫治疗和靶向治疗，表现为更慢的肿瘤生长速率。
• BCTA给药显著减弱MM TME内CXCL14⁺iCAFs和TREM2⁺TAMs的浸润。
• BCTA还减轻去分化表型并挽救CXCL13⁺CD8⁺T细胞的浸润。
• 在MDR HCC队列中，BCTA同样显著再致敏肿瘤对免疫治疗和靶向治疗，表现为更慢的肿瘤生长速率。
• BCTA给药显著减弱HCC TME内CXCL14⁺iCAFs和TREM2⁺TAMs的浸润。
• 毒性评估显示BCTA在huHSC小鼠中具有良好的安全性，主要器官H&E染色和血液学/血清生化指标未见显著异常。

讨论

核心发现

• 本研究通过整合单细胞和空间多组学，识别出一个复发性MDR相关空间生态位，位于肿瘤-基质界面，由CXCL14⁺iCAFs、TREM2⁺TAMs和AXL⁺去分化肿瘤细胞组成。
• 该生态位具有激活的油酸代谢和STAT1/STAT6转录因子平衡调控机制，共同在生物学和物理水平上实现对抗癌药物诱导的细胞毒性的抵抗。
• 工程化的靶向FAP和TREM2的双特异性抗体（BCTA）能够有效再致敏MDR，同时保持良好安全性。

MDR的保守演化轨迹

• 研究结果表明MDR的演化轨迹在不同癌症类型间遵循一定程度的保守范式，支持广泛适用的MDR再致敏策略的可行性。
• 该空间生态位在多种癌症类型中复发，包括MM、HCC、ccRCC、BRCA、STAD、COAD、PDAC、OS、ICC、BCC和NSCLC。

细胞-细胞相互作用机制

• CXCL14⁺iCAFs通过CXCR4依赖性机制促进巨噬细胞迁移和TREM2相关特征的诱导。
• TREM2⁺TAMs通过CD86-CTLA4检查点轴抑制CXCL13⁺CD8⁺T细胞。
• TREM2⁺TAMs通过油酸驱动的GAS6-AXL激活促进肿瘤去分化。
• 这些相互作用共同形成免疫抑制和耐药的微环境。

治疗策略

• BCTA双特异性抗体同时靶向CAFs和TAMs，破坏空间生态位并恢复治疗敏感性。
• BCTA通过增强ADCC效应特异性裂解CAFs和TREM2⁺TAMs。
• BCTA在MDR MM和HCC PDX模型中显著再致敏肿瘤对免疫治疗和靶向治疗。
• BCTA还减轻去分化表型并挽救CXCL13⁺CD8⁺T细胞的浸润。

临床意义

• TREM2⁺TAMs、AXL⁺肿瘤细胞和CXCL14⁺iCAFs与不良预后相关，而CXCL13⁺CD8⁺T细胞与有利临床结局相关。
• 这些细胞群体可作为MDR的预后标志物和潜在治疗靶点。
• BCTA代表一种有前景的治疗策略，用于再致敏MDR癌症。

局限性

• 研究主要基于MM发现队列，需要在更多癌症类型中进一步验证。
• 需要更大规模的临床试验来评估BCTA的安全性和有效性。
• 空间生态位的动态演化需要进一步研究。

方法总结

患者纳入和样本收集

• 从中山医院复旦大学附属医院收集新鲜样本，经机构审查委员会批准。
• MDR MM的纳入标准：经经验丰富的病理学家确认的MM诊断；先前接受至少两种治疗，包括免疫治疗、靶向治疗或化疗；初始放射学治疗反应证据随后出现肿瘤进展。
• MM TMA（n=102）、HCC TMA（n=209）、NSCLC TMA（n=60）和ccRCC TMA（n=60）样本从中山医院复旦大学附属医院和长沙湘雅生物样本库获得。

小鼠模型

• 五周龄雄性C57BL/6、BALB/c-nu、Trem2-/-和huHSC小鼠从上海模式生物中心购买。
• 所有动物护理和实验程序严格按照伦理指南进行，并经中山医院复旦大学动物伦理委员会批准。

细胞系和培养条件

• 人A375黑色素瘤细胞、小鼠B16黑色素瘤细胞和人THP-1单核细胞用于本研究。
• A375细胞在DMEM中维持，B16和THP-1细胞在RPMI 1640中维持。
• 稳定过表达AXL的A375和B16细胞以及过表达TREM2的THP-1细胞从OBIO Technology获得。

scRNA-seq

• 初治和MDR MM样本使用人肿瘤解离试剂盒解离用于scRNA-seq。
• scRNA-seq使用BGI C4平台进行，按照制造商协议。
• 原始测序数据使用BGI单细胞分析管道处理，比对到人类参考基因组（GRCh38）。

ST-seq（Visium）

• 四个MDR MM组织样本嵌入OCT并储存在-80°C。
• 组织切片为10 μm厚，在-20°C的冷甲醇中固定。
• 切片进行H&E染色、成像、脱色，并转移到Visium空间基因表达载玻片。
• 探针延伸和文库构建遵循标准Visium空间基因表达工作流程。

ST-seq（Xenium）

• 为了最小化批次效应并确保肿瘤间可比性，构建了泛癌FFPE组织微阵列（TMA）。
• FFPE TMA切片安装在Xenium载玻片上。
• 脱蜡和脱交联后，使用Xenium Human 5K Pan Tissue & Pathways Panel进行探针杂交。
• 载玻片在Xenium Analyzer上处理进行循环荧光解码。

AFADESI-MSI

• 三个初治和三个MDR MM组织样本在-20°C解冻30分钟，用5%羧甲基纤维素钠固定，使用Leica CM1950冷冻切片机切片为10 μm。
• MSI平台在负离子扫描模式下使用，喷雾溶剂为80%乙腈和20%水。

流式细胞术

• 对于表面染色，细胞与适当抗体在室温孵育15分钟。
• 对于细胞内染色，细胞使用Fixation/Permeabilization Kit固定和透化。
• 细胞分选在CytoFLEX SRT上进行。

TEM

• 流式细胞术分选的细胞在4°C的2.5%戊二醛中固定过夜。
• 细胞通过梯度乙醇脱水，嵌入环氧树脂，超薄切片（70 nm）使用超微切片机切割。

细胞-细胞共培养系统

• THP-1细胞稳定转导TREM2-OE或Vector对照慢病毒，使用PMA和肿瘤条件培养基分化为TAMs。
• 从健康志愿者血液样本分离外周血单核细胞，使用EasySep Human CD8+ T cell Isolation Kit纯化CD8+ T细胞。
• 纯化的CD8+ T细胞在RPMI 1640中培养，补充抗CD3/CD28和IL-2，在Vector对照TAMs或TREM2-OE TAMs存在下以1:1比例共培养96小时。

CCK-8和集落形成

• 对于CCK-8测定，每孔接种1,000个细胞。
• 在每个时间点（24、48、72和96小时），加入10 μL CCK-8溶液。
• 对于集落形成测定，细胞消化成单细胞悬液，每个6 cm培养皿接种1,000个细胞。

Western blot

• 细胞内蛋白质使用RIPA裂解缓冲液提取，补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。
• 蛋白质样品通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上。

小鼠肿瘤模型

• A375和B16细胞（5×10⁶）在第0天皮下注射。
• 对于靶向治疗组，Dabrafenib和Trametinib腹腔注射。
• 对于免疫治疗组，PD-1抗体腹腔注射。
• 对于huHSC小鼠，新鲜过量MDR人肿瘤组织分成10 mm³小块用于皮下植入，BCTA腹腔注射（10 mg/kg）。

ELISA

• 使用Human GAS6 ELISA Kit定量TREM2+/TAMs中GAS6的分泌水平。

蛋白质阵列

• 使用Human Phospho-Kinase Array Kit检测TREM2+/TAMs中的磷酸激酶水平。

qRT-PCR

• 在QuantStudio5上进行qRT-PCR。

脂质筛选

• 为了评估不同脂质类型对TAMs中GAS6表达的影响，首先通过在1:1混合的新鲜收集的肿瘤条件培养基和10% FBS补充的DMEM中培养BMDMs 72小时生成TAMs。
• TAMs然后用各种脂质处理48小时。

ChIP-qPCR和双荧光素酶报告基因测定

• 使用ChIP-IT High Sensitivity Kit进行ChIP-qPCR测定。
• 使用Dual-Luciferase Reporter Assay System进行双荧光素酶报告基因测定。

Transwell迁移测定

• 使用Transwell小室（24孔）评估THP1细胞的迁移能力。
• THP1细胞用PMA预处理2天。
• 对于迁移测定，5×10⁴诱导的THP1细胞重悬在无血清RPMI 1640中，接种到Transwell插入物的上室。
• THP1细胞然后用不同浓度的CXCL14处理：0、25、50和100 ng/mL。
• 此外，CXCR4抑制剂AMD3100添加到下室，最终浓度为10 μM。

BCTA生成

• BCTA基于专利申请（WO2019118513A1和US6455677B1）开发。
• 基因片段通过PCR扩增并克隆到适当的表达载体中。
• 重组质粒转染到FUT8-CHO细胞中表达，以获得去岩藻糖基化Fc设计并增强ADCC活性。
• 培养4天后，收集细胞，使用蛋白A亲和层析纯化蛋白质。

结合ELISA

• 为了检测BCTA与TREM2和FAP的亲和力，将2 μg/mL TREM2和FAP重组蛋白包被到每个孔中，在4°C孵育过夜。
• BCTA以梯度稀释（从200 nM开始）加入，在25°C孵育1小时。

ADCC测定

• 为了评估BCTA介导的ADCC活性，使用人外周血单核细胞（PBMCs）作为效应细胞进行体外细胞毒性测定。
• 靶细胞，包括患者来源的CAFs和TREM2-OE THP1细胞，接种到96孔板中。
• BCTA或同种型对照抗体连续稀释以建立浓度梯度，并与靶细胞孵育。
• 随后，新鲜分离的PBMCs以20:1的效应物与靶标（E:T）比例添加到共培养系统中。
• 在标准培养条件下孵育4小时后，使用基于LDH释放的细胞毒性测定法定量靶细胞的特异性裂解。

数据可视化

• 使用以下软件包进行可视化：R中的Seurat、ggplot2、ggrepel、ggpubr、survminer、pheatmap、ComplexHeatmap和cowplot，以及Python中的scTour。

定量和统计分析

• 在p < 0.05时考虑统计显著性，所有统计分析使用R（V4.1.0）、RStudio和GraphPad Prism 9（V9.4.1）进行。
• 组间比较使用Student's t检验、Wilcoxon秩和检验和单因素方差分析。
• 配对两组比较使用配对Wilcoxon符号秩检验。
• PLS-DA模型的显著性使用置换检验评估。
• 对于患者配对区域水平比较，应用Friedman检验，随后进行事后配对Wilcoxon符号秩检验。
• 除非另有说明，条形图代表平均值±标准差（SD），而线图代表平均值±标准误（SEM）。
• 箱线图显示中位数、四分位距和延伸到1.5倍四分位距的须。
• 每个实验至少独立重复三次，使用生物学 distinct 样本。

关键结论

1. 复发性MDR空间生态位：识别出一个位于肿瘤-基质界面的复发性多细胞生态位，由CXCL14⁺iCAFs、TREM2⁺TAMs和AXL⁺去分化肿瘤细胞组成，伴随CXCL13⁺CD8⁺T细胞的丢失。
2. TREM2⁺TAMs的免疫抑制功能：TREM2⁺TAMs显示免疫抑制性脂质代谢程序，通过CD86-CTLA4检查点轴抑制CXCL13⁺CD8⁺T细胞。
3. AXL驱动去分化和耐药：AXL是介导去分化亚群EMT和干性相关特征的调控因子，过表达导致对免疫治疗和靶向治疗的耐药。
4. CXCL14促进巨噬细胞迁移和TREM2诱导：CXCL14通过CXCR4依赖性机制促进巨噬细胞迁移和TREM2相关特征的诱导，STAT1/STAT6转录因子平衡调控TREM2表达。
5. BCTA双特异性抗体：靶向FAP和TREM2的双特异性抗体能够有效再致敏MDR，同时保持良好安全性，在MDR MM和HCC PDX模型中显著抑制肿瘤生长。
6. 临床意义：TREM2⁺TAMs、AXL⁺肿瘤细胞和CXCL14⁺iCAFs与不良预后相关，而CXCL13⁺CD8⁺T细胞与有利临床结局相关。这些细胞群体可作为MDR的预后标志物和潜在治疗靶点。
7. 保守的MDR演化轨迹：该空间生态位在多种癌症类型中复发，表明MDR的演化轨迹遵循一定程度的保守范式，支持广泛适用的MDR再致敏策略的可行性。

生活很好，有你更好。