课后补充--RFdiffusion + ProteinMPNN从头抗体设计

原创

追风少年i

发布于 2026-09-26 17:25:40

350

作者，Evil Genius

今天我们来梳理一下从头抗体设计的思路。

一、RFdiffusion从头设计抗体：完整路线

已知靶蛋白结构
                       │
                       ↓
              ① 靶蛋白结构准备
                       │
                       ↓
              ② 确定目标表位
                 Epitope
                       │
                       ↓
              ③ 定义设计区域
              hotspot / interface
                       │
                       ↓
              ④ RFdiffusion
          生成抗体结合骨架
                       │
                       ↓
             大规模生成候选
                       │
                       ↓
              ⑤ 结构过滤
        interface / RMSD / clash
                       │
                       ↓
              ⑥ ProteinMPNN
             设计氨基酸序列
                       │
                       ↓
              ⑦ 结构预测
        AlphaFold / ESMFold等
                       │
                       ↓
             ⑧ 复合物验证
          Target + designed binder
                       │
                       ↓
          ⑨ 界面/亲和力筛选
                       │
                       ↓
              ⑩ Rosetta优化
                       │
                       ↓
                 ⑪ MD验证
                       │
                       ↓
              ⑫ 实验表达筛选
                       │
                       ↓
                最终抗体

二、第一步：准备靶蛋白结构

假设已经有：

target.pdb

首先进行结构检查：

target.pdb
   ↓
去除不需要的配体
   ↓
检查缺失残基
   ↓
检查链
   ↓
添加必要氢原子
   ↓
检查结构质量
   ↓
target_clean.pdb

例如：

Target protein
     │
     ├── Chain A
     ├── Chain B
     └── ligand

需要先明确：

究竟是哪条链、哪个结构域、哪个表面区域是你希望抗体结合的位置。

三、第二步：确定 Epitope

这是整个过程非常关键的一步。

RFdiffusion并不是：

“让AI自己随便找靶蛋白表面。”

更常见、更可控的思路是：

你先告诉它希望 binder 接近靶蛋白的哪个区域。

例如：

Target protein

       ┌───────────────┐
      /                 \
     |                   |
     |      ★★★★★       |
     |      Epitope     |
     |                   |
      \                 /
       └───────────────┘
                ↑
          desired binder

如果你的目标是：

特异性结合某个突变位点

例如：

WT:
         ─── A ───

Mutant:
         ─── X ───
              ★

那么可以把突变附近表面作为设计区域。

四、第三步：确定 hotspot residues

这里是 RFdiffusion binder design 中非常重要的概念。

可以指定：

哪些靶蛋白残基必须参与结合。

例如：

Target

     100     105
      ↓       ↓
───── K ───── Y ─────
        \     /
         \   /
        hotspot

可以理解为：

Target protein
     ↓
hotspot residues
     ↓
RFdiffusion生成binder
     ↓
让binder interface靠近这些残基

也就是说：

hotspot是设计约束，而不是最终抗体序列。

五、第四步：RFdiffusion到底生成什么？

RFdiffusion首先生成的是：

3D protein backbone

而不是直接生成：

完整抗体氨基酸序列。

也就是说：

RFdiffusion
                     ↓
              3D backbone
                     ↓
             ┌─────────────┐
             │             │
             │    Binder   │
             │             │
             └─────────────┘

例如你给它：

Target
+
hotspot residues
+
binder length

它可以产生：

Target + new protein backbone

这属于：

de novo protein binder design

六、但是“从头设计抗体”和“设计蛋白binder”要区分

RFdiffusion最自然的任务是：

设计一个能够结合目标蛋白的新的蛋白骨架。

它并不天然等价于：

生成一个符合天然抗体 VH/VL 架构、具有完整免疫球蛋白折叠和标准 CDR 的抗体。

因此实际项目中需要区分两条路线：

路线 A：De novo protein binder

Target
 ↓
RFdiffusion
 ↓
New binder backbone
 ↓
ProteinMPNN
 ↓
Sequence

路线 B：Antibody-specific design

Target
 ↓
Epitope
 ↓
Antibody scaffold
 ↓
CDR design / constrained diffusion
 ↓
Antibody sequence

如果目标是真正的 IgG / Fab / scFv 抗体，就要特别关注抗体 scaffold 和 CDR 架构，而不能简单把任意 RFdiffusion binder 称为“抗体”。

七、第五步：生成大量候选结构

假设一次生成：

1000 structures

得到：

candidate_001.pdb
candidate_002.pdb
candidate_003.pdb
...
candidate_1000.pdb

这时候：

绝大多数候选都不能直接拿去做实验。

需要进行结构过滤。

八、第六步：第一轮结构过滤

主要看：

① 是否真正接触目标表位

Target
████████████████
██████★█████████
      ↑
   binder

而不是：

Target

████████████████

             binder

② 是否存在严重 clash

Bad:

Target
████████
   ████████
      ↑
    clash

③ 接触面积

一般希望形成合理的蛋白-蛋白界面。

关注：

interface area
buried surface area
contact residues

④ Shape complementarity

Target surface
     ∩
Binder surface

希望：

形状互补。

九、第七步：ProteinMPNN进行序列设计

RFdiffusion给的是：

Backbone

接下来需要：

ProteinMPNN 根据 backbone 设计氨基酸序列。

流程：

RFdiffusion backbone
        ↓
    ProteinMPNN
        ↓
Sequence 1
Sequence 2
Sequence 3
...

例如：

Binder backbone

       ↓

MPNN

       ↓

MKT...XXX...

所以可以简单记：

RFdiffusion负责“长什么样”；ProteinMPNN负责“由什么氨基酸组成”。

十、如果设计真正的抗体，序列设计还需要考虑什么？

需要关注：

VH
│
├── Framework
├── CDR-H1
├── CDR-H2
└── CDR-H3

VL
│
├── Framework
├── CDR-L1
├── CDR-L2
└── CDR-L3

尤其是：

CDR-H3

因为它往往是抗原识别的重要组成部分。

所以真正的 antibody design 不应该只看：

ProteinMPNN loss

还需要检查：

CDR构象
framework合理性
VH/VL interface
CDR长度
sequence developability
aggregation risk
liability motifs

十一、第八步：重新预测设计序列的结构

得到序列以后：

Designed sequence
        ↓
Structure prediction
        ↓
Predicted structure

可以采用 AlphaFold 系列等方法进行结构预测。

这里有两个问题：

问题1

这个序列能不能折叠成我们设计的 backbone？

问题2

它折叠以后还能不能结合靶蛋白？

所以不能只预测单体。

更重要的是：

Target
   +
Designed binder
   ↓
complex prediction

十二、第九步：检查“设计结构”和“预测结构”是否一致

这是一个非常重要的过滤步骤。

假设：

RFdiffusion设计：

        Target
          │
        Binder
          ↓
       interface

预测之后：

Predicted:

        Target
          │
          │
       Binder
          ↘

如果结构发生很大变化：

这个设计可能不可靠。

因此需要比较：

design vs prediction

例如：

backbone RMSD
interface RMSD
secondary structure consistency
confidence
interface contacts

十三、第十步：检查抗原-抗体界面

需要分析：

Target
   │
   ├── Epitope residues
   │
   ├── H-bonds
   │
   ├── Salt bridges
   │
   ├── Hydrophobic contacts
   │
   ├── π interactions
   │
   └── van der Waals
          ↑
        Binder

特别需要问：

设计出来的 binder 到底是不是通过预期的 Epitope 结合？

十四、第十一步：特异性设计

如果你只追求：

“结合目标蛋白”

还不够。

真正的抗体开发还需要：

Target binding + Off-target avoidance

例如：

Designed antibody
       │
       ├──────── Target
       │             ↓
       │          strong
       │
       ├──────── WT
       │             ↓
       │          weak
       │
       ├──────── Homolog 1
       │             ↓
       │          weak
       │
       └──────── Homolog 2
                     ↓
                   weak

所以可以进行：

Positive design

增强：

Target interaction

Negative design

削弱：

Off-target interaction

这对：

突变体特异性抗体

尤其重要。

十五、第十二步：Rosetta / PyRosetta优化

假设：

CDR-H3
      ↓
Residue 1
Residue 2
Residue 3
Residue 4

进行计算突变：

A → F
A → Y
A → W
A → L
...

然后计算：

interface energy
ΔΔG
hydrogen bonds
packing
buried surface
steric clash

筛选：

Candidate 1
Candidate 2
Candidate 3
...

十六、第十三步：MD验证

然后进入分子动力学：

Target + designed antibody
          ↓
        MD
          ↓
     trajectory
          ↓
 ┌────────┼────────┐
 ↓        ↓        ↓
RMSD      Rg     H-bonds
 ↓        ↓        ↓
Interface stability

重点看：

RMSD

复合物是否稳定。

Interface contacts

接触是否持续存在。

Hydrogen bonds

关键氢键是否保持。

SASA/BSA

界面是否稳定。

MM/GBSA 或 MM/PBSA

可以作为相对比较指标，但不要把它当成实验亲和力的直接替代。

十七、第十四步：最后得到候选抗体

经过多轮筛选：

10000 generated
      ↓
3000 structural filters
      ↓
500 sequence designs
      ↓
100 predicted structures
      ↓
20 interface candidates
      ↓
5–20 experimental candidates

最终进入实验：

DNA synthesis
      ↓
Expression
      ↓
Purification
      ↓
Binding assay
      ↓
BLI / SPR
      ↓
Specificity
      ↓
Cell assay

十八、整个 RFdiffusion + ProteinMPNN + AF + Rosetta + MD 的位置

可以把几个软件的角色记成：

工具	主要负责什么
RFdiffusion	生成新的蛋白骨架
ProteinMPNN	根据骨架设计氨基酸序列
AlphaFold/其他结构预测	检查序列能否形成预期结构/复合物
Rosetta/PyRosetta	结构优化、界面设计、能量评估
Docking	探索/验证抗原-设计蛋白结合模式
MD	检查复合物动态稳定性
BLI/SPR	实验测结合动力学/亲和力
ELISA	实验检测结合
细胞实验	验证实际生物学功能

十九、如果真正想做“从头抗体”，建议三种路线

路线 ① De novo binder

最适合理解 RFdiffusion：

Target
 ↓
Epitope
 ↓
RFdiffusion
 ↓
Binder backbone
 ↓
ProteinMPNN
 ↓
Binder sequence

它得到的是：

全新的蛋白结合分子

不一定是传统 IgG 抗体。

路线 ② Antibody scaffold + CDR设计

Target
 ↓
Epitope
 ↓
选择 VH/VL scaffold
 ↓
设计 CDR
 ↓
Antibody structure
 ↓
Docking
 ↓
Optimization

更接近：

传统抗体工程

路线 ③ AI + 抗体库/VDJ

这个与你前面问的 VDJ 可以连接起来：

天然BCR/VDJ repertoire
           ↓
       VH / VL
           ↓
      CDR sequence
           ↓
   Structure prediction
           ↓
Antigen-antibody docking
           ↓
   AI/计算优化
           ↓
Experimental screening

这种路线不是完全 de novo，而是：

从天然免疫受体序列出发进行抗体发现和优化。

二十、总结成一张总图

TARGET PROTEIN
                         │
                         ↓
                  Structure analysis
                         │
                         ↓
                     EPITOPE
                         │
                         ↓
                 Hotspot residues
                         │
                         ↓
                  ┌──────────────┐
                  │ RFdiffusion  │
                  └──────┬───────┘
                         ↓
                 Binder backbones
                         │
                         ↓
               Structure filtering
                         │
                         ↓
                  ┌──────────────┐
                  │ ProteinMPNN   │
                  └──────┬───────┘
                         ↓
                  Binder sequences
                         │
                         ↓
              Structure prediction
                         │
                         ↓
               Target + Binder
                         │
                         ↓
               Interface analysis
                         │
             ┌───────────┴───────────┐
             ↓                       ↓
        Target binding          Off-target
             ↓                       ↓
          Positive               Negative
           design                design
             └───────────┬───────────┘
                         ↓
                 Rosetta / PyRosetta
                         ↓
                       MD
                         ↓
                 Candidate ranking
                         ↓
                Experimental test
                         ↓
                     Lead binder

最关键的理解

RFdiffusion ≠ “输入靶蛋白，输出抗体”。

靶蛋白结构 + 目标表位/热点约束 → RFdiffusion生成结合骨架 → ProteinMPNN设计序列 → 结构预测验证 → 界面筛选 → Rosetta/MD优化 → 实验验证。

生活很好，有你更好。

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