文献分享（xenium）--胰腺癌异质性与免疫逃逸中的丝氨酸蛋白酶抑制剂-髓系细胞轴

作者，Evil Genius

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摘要

胰腺导管腺癌（PDAC）以高度免疫抑制、细胞外基质丰富的微环境为特征，但肿瘤表现出显著的异质性。这提出了一个问题：免疫抵抗是肿瘤的全局属性，还是在空间受限的生态位内组织起来的。本研究利用Perturb-map空间功能基因组学，确定了不同基因如何在空间和时间上塑造PDAC克隆的生长和细胞环境。该分析揭示了早期基因驱动的局部免疫邻域重塑，先于晚期空间克隆优势的出现。研究识别出SERPINE1（编码纤溶酶原激活物抑制剂1，PAI1）和SERPINB2（编码PAI2）作为肿瘤微环境控制和免疫逃逸的主要调控因子。这些丝氨酸蛋白酶抑制剂促进富含纤维蛋白的细胞外基质生态位的稳定，这些生态位在空间上保留巨噬细胞并将其编程为免疫抑制状态，同时排除细胞毒性T细胞。Serpine1或Serpinb2的缺失，或PAI1或CD18的药理学抑制，改善了小鼠的肿瘤控制，并与抗PD-1协同作用。患者肿瘤的多模态空间分析显示，免疫抑制生态位围绕罕见的SERPINB2和SERPINE1表达的PDAC亚群形成，以SPP1+/MARCO+巨噬细胞为主。这些发现将癌症来源的SERPINE1和SERPINB2识别为免疫抑制的局部空间组织者，将肿瘤内在异质性与局部微环境控制和PDAC免疫治疗耐药联系起来。

引言

PDAC的临床挑战

• PDAC是最致命的恶性肿瘤之一，五年生存率仅为13%。
• 尽管免疫治疗改善了几种癌症的预后，但在PDAC中疗效有限。
• 肿瘤微环境（TME）的组成是免疫治疗耐药的关键因素，T细胞浸润是免疫治疗反应最强的相关因素之一。
• 部分PDAC几乎完全缺乏CD8+ T细胞，而在T细胞存在的肿瘤中，它们经常处于耗竭状态。
• 这被认为是由于免疫抑制性免疫和基质细胞的富集，以及致密细胞外基质（ECM）的沉积，后者可阻碍T细胞浸润和细胞毒性活性。

PDAC免疫抑制TME的建立机制

• PDAC如何建立其免疫抑制TME仍知之甚少，但证据指向肿瘤来源细胞外因子的关键作用。
• 尽管单细胞和空间 profiling 研究已识别出候选受体-配体相互作用和其他细胞外介质，但许多的功能贡献仍不清楚。
• 空间转录组学提示许多这些配体由 distinct 生态位内的空间局部肿瘤细胞群体产生，提出了可溶性TME调控因子的表达改变是克隆选择驱动因素的可能性。

研究目标与方法

• 本研究旨在识别促进PDAC生长和免疫逃逸的细胞外因子。
• 使用Perturb-map（空间功能基因组学平台），发现局部免疫生态位的重塑先于并可能驱动克隆适应性和空间优势的差异。
• 识别出Serpine1（编码PAI1）和Serpinb2（编码PAI2）作为适应性免疫压力下免疫逃逸的主要调控因子。
• 这些因子促进巨噬细胞保留和极化，建立局部免疫抑制生态位，并限制抗肿瘤T细胞活性。
• 该通路的遗传或药理学破坏改善了肿瘤控制，并使PDAC对PD-1阻断敏感。
• 研究结果将丝氨酸蛋白酶抑制剂识别为以纤维蛋白积累为特征的免疫抑制肿瘤生态位的主动组织者，并建立利用丝氨酸蛋白酶抑制剂-纤维蛋白-巨噬细胞轴作为 dismantling 免疫抑制微环境架构和增强PDAC免疫治疗疗效的潜在策略。

结果部分 1：PDAC中肿瘤来源的TME调控因子

候选基因识别策略

• 分析人类和小鼠PDAC单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集，识别在癌前或恶性细胞中主要表达、编码细胞外或细胞表面蛋白的基因。
• 为了富集通过肿瘤-微环境相互作用而非细胞内在适应性程序起作用的因子，将这些候选者与来自46种人类PDAC细胞系的CRISPR-Cas9依赖性数据整合，选择对体外生长影响最小的基因，提示其主要功能可能通过与环境相互作用在体内特异性出现。

候选基因特征

• 该策略产生了一组多样化的肿瘤表达细胞外调控因子，包括参与ECM组织、免疫信号和凝血或纤溶通路的因子。
• 几个候选者属于在小鼠和人类PDAC中反复观察到的已建立信号家族，包括IL-1、EGF和丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中一些已与恶性进展相关，包括IL1b和IL33。
• 然而，许多这些基因对PDAC生长和TME形成的因果效应仍知之甚少。

结果部分 2：细胞外因子塑造克隆命运

Perturb-map方法

• Perturb-map将混合体内CRISPR扰动与蛋白质条形码（Pro-Codes）和多路成像相结合，实现原位空间分辨、肿瘤和TME特异性表型分析。

基线克隆追踪模型

• 在引入遗传扰动之前，建立了基于Pro-Code的克隆追踪模型，以定义体内PDAC肿瘤的基线生长和空间组织。
• 生成同系原位模型，使用KPC（KrasLSL-G12D/+; Trp53LSL-R172H/+; Pdx1-cre）细胞标记35个Pro-Codes文库。
• Pro-Code频率在植入前后保持稳定，表明中性标记。

Pro-Code/CRISPR文库构建

• 构建Pro-Code/CRISPR（PC/CRISPR）文库以敲除34个优先基因，以及一个未表达的对照基因（F8），并将其引入KPC细胞。
• 没有扰动影响体外细胞适应性，无论是在KPC细胞中还是在DepMap数据集中的46种人类PDAC细胞系中。

体内实验设计

• 将KPC PC/CRISPR细胞池原位植入同系免疫competent小鼠。
• 在D7、D14和D21收集肿瘤，分别代表早期、中期和晚期生长阶段。
• 对肿瘤切片进行多重分析，检测Pro-Code、连锁遗传扰动和局部免疫组成。

克隆架构的动态变化

• 成像显示Pro-Code+肿瘤细胞克隆架构的动态、空间分辨转变。
• 在早期（D7），肿瘤表现出高瘤内异质性， distinct 基因敲除细胞群体广泛混合。
• 到D21，这种早期镶嵌演变为更局限和局部均匀的生长模式， distinct 敲除群体主导特定区域。
• D7时， focal 区域内特定敲除细胞的频率显示群体间更均匀的分布，反映肿瘤细胞的高度混合状态。
• 到D14，尤其是D21，分布转向单一群体的主导，突出空间巩固克隆区域的出现。
• 克隆多样性指标分析显示克隆均匀度进行性下降，到D21显著降低，表明局部克隆代表性的不平衡增加。
• 因此，晚期看到的均匀性不反映组织如何播种，而是竞争性演化的结果，其中 distinct 基因敲除群体随着癌症克隆生长和与微环境相互作用在特定区域内变得更加巩固。

克隆适应性差异

• 量化每个PC/CRISPR相对于对照肿瘤的代表性，将个体小鼠视为生物学重复。
• 虽然大多数敲除在D7以相似频率存在，但随时间出现显著适应性差异。
• 到D21，11个敲除富集，12个耗竭。
• 耗竭的扰动包括已建立的PDAC调控因子如Pthlh和Il33，以及丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员，包括Serpine1和Serpinb2。
• 相比之下，Ly6d、Serpinb5或Celsr1的缺失导致克隆富集。
• 由于这些扰动不影响体外癌细胞适应性，其在体内的效应可能反映与TME的相互作用改变，而非增殖的内在控制。

结果部分 3：生态位建模先于克隆选择

免疫邻域分析

• 为了理解每个基因如何以及何时影响癌症克隆的局部细胞生态位，检查了基因敲除克隆近端邻域中关键免疫细胞类型的组成和空间定位随时间的变化。
• 分析超过450万个癌症和免疫细胞（跨20只小鼠）揭示敲除克隆之间的主要时空差异，这些差异在7天出现，到21天变得更加明显。
• 尽管PDAC TME具有异质性，观察到一致且可重复的免疫细胞分布模式，随时间保持。

两个 distinct TME模块

• 对每个基因敲除的邻域富集z-score进行聚类，识别出两个 distinct TME模块，两者均与相对于内部对照的适应性劣势相关。
• 第一个簇，包括Serpinb2和Serpine1，显示CD8a阳性细胞富集增加，CD4、B220和F4/80阳性细胞减少，表明免疫抑制较少的局部生态位。CD8a阳性细胞在D14 transient 减少，然后在D21重新出现，提示肿瘤演化过程中免疫微环境的动态空间重组。
• 相比之下，第二个簇，包含九个基因敲除，包括Pthlh、Muc1和Il1a，与更免疫富集的环境相关。Cd9的缺失最初中性，但导致晚期适应性优势，伴随肿瘤巨噬细胞富集和CD8 T细胞耗竭。

时间分离

• 值得注意的是， distinct 免疫邻域已在D14建立，此时肿瘤内仍存在大量克隆混合。这种时间分离表明基因驱动的局部免疫生态位重塑是早期事件，可以先于随后的克隆适应性和空间优势差异。

结果部分 4：Serpinb2和Serpine1介导免疫逃逸

适应性免疫的作用

• 为了评估适应性免疫系统在塑造基因敲除肿瘤表型中的贡献，将KPC PC/CRISPR细胞池原位移植到Rag2-/-小鼠，后者缺乏T细胞和B细胞。
• 移植后两周收集肿瘤，这是大多数基因敲除具有完全形成和稳定TME的中间阶段。
• 值得注意的是，丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的基因敲除，包括Serpinb2和Serpine1，是相对于对照敲除生长最快的。
• 鉴于Serpinb2和Serpine1敲除在免疫competent背景下同时间点被耗竭，差异显著。
• 这些发现表明Serpinb2和Serpine1的缺失在缺乏适应性免疫的情况下赋予生长优势。
• 与此一致，Serpinb2-KO和Serpine1-KO邻域在免疫competent肿瘤中富集CD8+ T细胞并耗竭巨噬细胞，提示这些基因通过塑造局部免疫组织促进肿瘤适应性。

Serpinb2和Serpine1促进CD8 T细胞排除

• Serpine1编码PAI1，Serpinb2编码PAI2——这些是丝氨酸蛋白酶抑制剂，阻断尿激酶纤溶酶原激活物（uPA）和组织纤溶酶原激活物（tPA）活性并稳定纤维蛋白。
• 两种丝氨酸蛋白酶抑制剂均与不良癌症预后相关，对人类TCGA和GTEx bulk RNA-seq的分析发现SERPINB2和SERPINE1在癌症中相对于正常组织优先表达。
• 此外，独立患者队列的荟萃分析显示，任一基因的高表达与多种癌症类型（包括PDAC）的生存降低相关。

个体敲除验证

• 在KPC细胞中生成Serpinb2和Serpine1的个体敲除。
• 两种敲除均不影响体外细胞增殖，与混合PC/CRISPR体外和DepMap分析一致。
• 相比之下，当KPC肿瘤原位移植到免疫competent小鼠时，Serpinb2和Serpine1敲除减缓肿瘤生长，与对照敲除相比平均肿瘤负荷减少超过50%，并延长生存。

免疫群体分析

• 由于Perturb-map识别出Serpinb2-KO和Serpine1-KO克隆近端CD8+ T细胞数量增加，通过流式细胞术量化肿瘤浸润免疫群体。
• Serpin敲除肿瘤含有比对照多两倍以上的CD8+ T细胞。
• 为了进一步表征这种反应，对来自Serpinb2、Serpine1和对照敲除的肿瘤进行scRNA-seq。
• T细胞群体分析显示，Serpinb2-KO和Serpine1-KO肿瘤中终末耗竭T细胞分别减少3.5倍和1.7倍，同时CD8效应T细胞增加。
• 一致地，免疫染色显示瘤内CD8+ T细胞显著增加，包括GZMB+CD8+ T细胞增加超过四倍。

适应性免疫依赖性

• 为了直接测试Serpinb2和Serpine1缺失的生长抑制效应是否由适应性免疫介导，将Serpinb2-KO、Serpine1-KO或对照敲除KPC细胞移植到Rag2-/-小鼠。
• 与免疫competent宿主相比，丝氨酸蛋白酶抑制剂敲除肿瘤在这种情况下生长更快，正如在Perturb-map实验中发现的那样。
• 这种表型也在NSG小鼠中重现，后者缺乏T细胞、B细胞和自然杀伤（NK）细胞。
• 这些结果表明，癌细胞产生Serpinb2和Serpine1促进细胞毒性T细胞排除和耗竭，并促进胰腺肿瘤逃逸免疫控制。

结果部分 5：Serpinb2和Serpine1驱动抗PD-1耐药

ICB耐药测试

• PDAC对免疫检查点阻断（ICB）高度难治，基因工程KPC肿瘤同样对抗PD-1无反应。
• 鉴于Serpinb2和Serpine1保护PDAC细胞免受T细胞清除，测试了它们对PDAC抵抗ICB的影响。
• 将对照敲除和丝氨酸蛋白酶抑制剂敲除KPC细胞移植到免疫competent小鼠的胰腺，10天后开始IgG或抗PD-1治疗。
• 抗PD-1单药治疗对对照敲除肿瘤的生长几乎没有影响。
• 删除Serpine1或Serpinb2联合抗PD-1几乎使中位生存时间翻倍，从对照肿瘤抗PD-1治疗的24天增加到Serpinb2-KO或Serpine1-KO肿瘤的47天。

药理学抑制

• 接下来测试PAI1的药理学抑制是否能实现类似效果（选择性PAI2抑制剂不可用）。
• 将KPC或KC（KrasLSL-G12D/+; Ptf1acre/+）PDAC细胞植入胰腺，当肿瘤建立后，开始使用PAI1抑制剂PAI-039治疗，单独或联合抗PD-1。
• 尽管抗PD-1单药治疗仍然无效，联合治疗在两种PDAC模型中显著延长生存。
• 这些结果表明Serpinb2和Serpine1促进ICB耐药，PAI1阻断可以改善抗PD-1反应。

临床相关性

• 尽管人类PDAC临床对ICB无反应，但当检查肾细胞癌患者数据（JAVELIN Renal 101试验）时，发现患者肿瘤中高SERPINE1表达与更差的无进展生存相关，进一步支持丝氨酸蛋白酶抑制剂在免疫治疗耐药中的作用。

结果部分 6：Serpinb2和Serpine1促进抑制性程序

Perturb-map Multi-modal开发

• 为了帮助定义Serpinb2和Serpine1如何塑造TME，开发了Perturb-map Multi-modal，它整合了多重蛋白质组成像与空间转录组学在同一组织切片上，以单细胞分辨率同时分配遗传扰动、转录状态和空间背景。

聚焦文库

• 为了提供评估丝氨酸蛋白酶抑制剂功能的通路背景，生成了一个聚焦的Perturb-map文库，靶向Serpinb2和Serpine1以及PDAC细胞表达的其他纤溶和凝血相关基因。
• 将KPCcoag/fib-KO池原位移植，两周后使用Perturb-map Multi-modal分析肿瘤。

转录程序改变

• 空间图显示大多数肿瘤细胞形成离散灶，相对于对照区域显示 distinct 转录状态。
• 空间转录组学分析发现，Serpinb2缺陷和Serpine1缺陷癌细胞均下调与纤溶、ECM重塑、TGFβ信号和髓系趋化性相关的通路。
• 这些变化伴随上皮-间充质转化、缺氧、血管生成、糖酵解和氧化应激程序减少，与肿瘤促进和免疫调节状态的抑制一致。

关键基因变化

• Serpinb2缺陷和Serpine1缺陷癌细胞下调Tgfb1，免疫抑制的关键调控因子，并上调Il7和Il15，促进T细胞扩增和记忆形成的细胞因子。
• Serpinb2-KO肿瘤还下调Mif和Spp1（编码骨桥蛋白），而Serpine1-KO细胞显示Ccl2（髓系趋化吸引物）和Thbs1（参与潜伏TGFβ激活的基质细胞蛋白）表达减少。
• 这些分析表明Serpinb2和Serpine1促进与髓系趋化、T细胞抑制和PDAC微环境重塑相关的共享转录程序。

结果部分 7：Serpinb2和Serpine1调控ECM重塑

基质架构分析

• 由于丝氨酸蛋白酶抑制剂缺失下调与基质重塑和免疫抑制信号相关的肿瘤程序，接下来检查基质架构。
• Serpine1-KO肿瘤显示癌症相关成纤维细胞（CAFs）减少，而Serpinb2-KO肿瘤显示无显著减少。
• CAF亚型组成 largely 保持，观察到适度变化。
• 尽管存在这些差异，两种丝氨酸蛋白酶抑制剂敲除中胶原沉积均减少。
• 相比之下，内皮区室 largely 不变。

纤维蛋白沉积

• PAI1和PAI2抑制纤溶酶生成，从而防止纤维蛋白降解。
• 与此角色一致，在原位PDAC肿瘤中容易检测到纤维蛋白（原）密集区域。
• Serpinb2-KO和Serpine1-KO肿瘤均显示纤维蛋白（原）沉积减少，表明每个基因独立促进PDAC中纤维蛋白积累。
• 这些数据表明癌症产生的Serpine1和Serpinb2通过促进胶原和纤维蛋白沉积重塑ECM。

结果部分 8：TAMs介导丝氨酸蛋白酶抑制剂免疫抑制

巨噬细胞减少

• 除了形成结构支架外，纤维蛋白可以作为细胞锚点，通过与整合素如αMβ2（由CD11b和CD18组成）结合，后者在巨噬细胞和中性粒细胞中高表达。
• Serpine1-KO和Serpinb2-KO肿瘤均显示相对于对照巨噬细胞丰度减少，Serpine1缺失后效应尤其明显，巨噬细胞减少高达80%。
• 中性粒细胞在Serpinb2-KO肿瘤中减少，但在Serpine1-KO肿瘤中 largely 不变。

巨噬细胞作为共享下游效应器

• 由于巨噬细胞在两种敲除中一致减少，聚焦于巨噬细胞作为共享下游效应器。
• 对小鼠和人类胰腺肿瘤进行纤维蛋白（原）、PAI1、PAI2、癌细胞和巨噬细胞标记物染色，并将分析限制在中央肿瘤区域以最小化边界效应。
• 在纤维蛋白（原）密集区域内，巨噬细胞定位显著更接近CK19+PAI1+和CK19+PAI2+肿瘤细胞。
• 这种模式在30例PDAC患者的独立队列中保守，巨噬细胞同样富集在含有PAI1或PAI2+癌细胞的肿瘤区域。
• 总之，这些发现表明巨噬细胞优先定位在富含纤维蛋白（原）的肿瘤生态位内，支持一个模型，其中癌细胞来源的PAI1和PAI2通过促进纤维蛋白依赖性巨噬细胞积累塑造局部免疫架构。

巨噬细胞耗竭实验

• 为了测试巨噬细胞是否介导Serpinb2和Serpine1的肿瘤保护效应，使用抗CSF1抗体和氯膦酸盐脂质体耗竭携带对照或丝氨酸蛋白酶抑制剂敲除肿瘤的小鼠中的巨噬细胞。
• 再次发现Serpinb2-KO和Serpine1-KO肿瘤在载体处理条件下表现出减少的生长。
• 巨噬细胞耗竭导致类似的肿瘤生长减少。
• 然而，从丝氨酸蛋白酶抑制剂敲除肿瘤中耗竭巨噬细胞没有额外的减少，表明巨噬细胞是丝氨酸蛋白酶抑制剂驱动肿瘤进展所必需的。

CD18阻断实验

• 接下来测试αMβ2介导的巨噬细胞-纤维蛋白相互作用是否是丝氨酸蛋白酶抑制剂依赖性肿瘤保护所必需的。
• 用CD18阻断抗体治疗荷瘤小鼠以破坏αMβ2依赖性巨噬细胞与纤维蛋白的接合。
• CD18阻断诱导的免疫重塑 closely 镜像Serpinb2和Serpine1缺失，减少肿瘤相关和ARG1+巨噬细胞，增加GZMB+CD8+ T细胞。
• 与这些变化一致，CD18阻断显著减少肿瘤生长，而联合CD18阻断和丝氨酸蛋白酶抑制剂敲除没有产生加性效应。
• 此外，CD18阻断增强了PD-1阻断的抗肿瘤活性，表明破坏αMβ2介导的巨噬细胞保留可以改善对免疫检查点治疗的反应性。
• 总之，这些数据支持一个机制，其中Serpine1和Serpinb2通过促进αMβ2介导的巨噬细胞在富含纤维蛋白的肿瘤生态位内积累来促进PDAC进展，从而建立巨噬细胞驱动的免疫抑制微环境。

结果部分 9：丝氨酸蛋白酶抑制剂通过纤维蛋白生态位塑造TAM状态

巨噬细胞状态分析

• 对来自Serpinb2-KO和Serpine1-KO肿瘤的巨噬细胞进行scRNA-seq分析，显示相对于对照富集炎症、干扰素和细胞因子产生程序。
• Serpinb2-KO和Serpine1-KO肿瘤诱导TAM区室 largely 一致的变化，包括Cxcl9+巨噬细胞增加，与抗肿瘤免疫和有利预后相关，以及增殖巨噬细胞减少。
• Serpine1-KO肿瘤还显示免疫抑制性Spp1+/Marco+巨噬细胞大幅减少。

纤维蛋白与巨噬细胞状态的关系

• 为了进一步检查纤维蛋白与巨噬细胞状态之间的关系，使用来自“纤维蛋白原结合”Gene Ontology术语的基因计算纤维蛋白（原）结合评分。
• Arg1+巨噬细胞，包括Spp1+/Marco+亚群，显示最高评分，将免疫抑制性巨噬细胞状态与富含纤维蛋白的生态位联系起来。
• 与此一致，在PDAC条件培养基存在下在纤维蛋白包被表面培养的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）显示ARG1和PD-L1表达增加，与塑料对照上生长的巨噬细胞相比，而没有显著相应的共刺激标记CD86增加。
• 用argatroban monohydrate抑制凝血酶活性并没有逆转纤维蛋白诱导的ARG1或PD-L1表达增加，表明观察到的巨噬细胞极化主要由纤维蛋白本身驱动，而非残留凝血酶活性。
• 因此，在这种背景下，纤维蛋白增强免疫抑制性巨噬细胞极化。

结果部分 10：丝氨酸蛋白酶抑制剂生态位含有抑制性TAMs

人类PDAC空间分析

• 为了确定免疫抑制性巨噬细胞亚群是否同样与表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的癌细胞相关，使用空间转录组学在独立PDAC队列中分析空间定位和微环境背景。
• SERPINB2表达 largely 限于癌症富集区域，而SERPINE1显示更广泛的空间分布，延伸到基质区室，包括CAF和内皮主导区域。
• 然而，SERPINB2+和SERPINE1+恶性区域均一致嵌入免疫抑制性髓系富集邻域，其特征是SPP1+/MARCO+和增殖巨噬细胞富集。
• 在这个共同框架内，SERPINB2相关生态位额外包括中性粒细胞和浆细胞，而SERPINE1相关生态位显示与IL1B+髓系细胞和促纤维化基质程序更大的耦合。
• 这些空间关联 closely 镜像KPC模型中识别的巨噬细胞和纤维蛋白富集生态位，支持丝氨酸蛋白酶抑制剂依赖性免疫架构在物种间的保守性。

结果部分 11：SERPINB2/E1定义人类PDAC状态

人类PDAC scRNA-seq分析

• 对来自多个队列的整合人类PDAC scRNA-seq compendium 中SERPINB2和SERPINE1表达的分析揭示表达SERPINB2或SERPINE1的离散癌细胞亚群。
• 跨患者，变异性主要由serpin+肿瘤细胞的比例驱动，而阳性细胞中的每细胞表达相对稳定。
• 大多数表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的癌细胞表达SERPINB2或SERPINE1，少于20%共表达两者。
• 映射PDAC转录亚型显示SERPINB2和SERPINE1表达肿瘤细胞在basal-like PDAC中富集。
• 肿瘤治疗状态显示治疗初治和neoadjuvant治疗样本之间无显著差异。
• 结合小鼠数据证明适应性免疫依赖性选择表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的克隆，这些发现表明丝氨酸蛋白酶抑制剂相关恶性状态可能在PDAC TME中赋予选择优势。

差异表达分析

• 差异基因表达和通路富集分析显示，在人类PDAC中，SERPINB2+和SERPINE1+肿瘤细胞共享一组核心上调基因（196个基因），包括CCL2（单核细胞招募的关键因子）和CSF2、IL34、TGFB2、THBS1和PTGS2，这些促进巨噬细胞极化。
• 这支持PDAC中与免疫调节相关的丝氨酸蛋白酶抑制剂相关上皮程序的保守性。

结果部分 12：表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的细胞主导局部免疫

克隆混合实验

• 在人类和小鼠胰腺肿瘤中，SERPINB2和SERPINE1仅由恶性细胞的一个亚群表达，并与非丝氨酸蛋白酶抑制剂表达细胞的 distinct 微环境组分相关。
• 因此，研究团队询问这个少数群体是否足以驱动更广泛的TME重塑并发挥主导、非细胞自主效应。
• 为了模拟患者肿瘤中丝氨酸蛋白酶抑制剂阳性肿瘤细胞的低频率，将95% Serpine1-KO KPC细胞与5%表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的对照KPC细胞共移植。
• 引入这个小群体导致野生型丝氨酸蛋白酶抑制剂细胞在体内优先扩增，肿瘤生长和免疫表型向对照肿瘤转变。
• 混合肿瘤转向更免疫抑制状态，巨噬细胞丰度增加，GZMB+CD8+ T细胞浸润减少。
• 尽管仅注射5%，对照细胞在实验终点扩展到约17%的肿瘤细胞（与人类肿瘤中常见比例相当），表明它们具有竞争优势，并强化了表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的细胞可以不成比例地影响肿瘤生态系统的概念。

空间分辨分析

• 为了确定丝氨酸蛋白酶抑制剂依赖性免疫重塑反映全局肿瘤范围重编程还是局部运作，研究团队对同质和混合丝氨酸蛋白酶抑制剂野生型和敲除肿瘤区域内的免疫组成进行了空间分辨分析。
• CD8+ T细胞积累在局部同质Serpine1-KO区域保持稳健，重现单敲除肿瘤中观察到的免疫表型。
• 相比之下，含有较高比例对照肿瘤细胞的混合区域显示显著减弱和增加的CD8+ T细胞浸润异质性。
• 值得注意的是，在Serpine1-KO混合物中，CD8+ T细胞丰度随着对照（表达丝氨酸蛋白酶抑制剂）肿瘤细胞的局部比例增加而减少。
• 含有甚至小比例丝氨酸蛋白酶抑制剂 proficient 细胞的区域已经显示CD8+ T细胞浸润减少，增加丝氨酸蛋白酶抑制剂野生型细胞数量并未导致比例性的额外减少。
• 因此，免疫抑制不是随着肿瘤细胞组成分级；相反，表达Serpine1的肿瘤细胞的存在局部和主导地起作用，使得相对较少的细胞足以抑制共享空间生态位内的CD8+ T细胞积累。
• 这为罕见丝氨酸蛋白酶抑制剂阳性肿瘤状态如何驱动人类PDAC中广泛的TME重塑提供了机制解释。

讨论

核心发现

• PDAC的一个定义特征是其免疫抑制、ECM丰富的微环境，但肿瘤仍然高度异质性，提出了免疫抵抗是反映全局肿瘤属性还是在空间受限生态位内组织的问题。
• 使用Perturb-map，研究团队显示基因驱动的局部免疫邻域重塑是早期事件，可以先于空间克隆优势，并导致免疫抑制、T细胞排除微环境的区域域，使克隆生长成为可能。

SERPINE1和SERPINB2作为主要驱动因子

• 研究识别出SERPINE1和SERPINB2作为TME控制和免疫逃逸的主要肿瘤来源驱动因子。
• 不是通过弥漫或全局纤维化起作用，数据表明丝氨酸蛋白酶抑制剂驱动的纤维蛋白重塑建立局部和指导性ECM生态位，编程促肿瘤巨噬细胞；这种关系在人类胰腺肿瘤中保守。
• 这定义了一个机制轴，连接肿瘤来源丝氨酸蛋白酶抑制剂、富含纤维蛋白的ECM组成和巨噬细胞极化。
• 值得注意的是，Serpine1或Serpinb2的缺失或PAI的药理学抑制改善了肿瘤控制并与PD-1阻断协同，识别Serpine1和Serpinb2作为ECM相关调控因子，贡献于免疫治疗耐药。

ECM作为免疫细胞定位和极化的指导性组织者

• 尽管ECM通常被视为免疫治疗的物理屏障，研究结果支持特定ECM组分作为免疫细胞定位和极化的指导性组织者的角色。
• 尽管丝氨酸蛋白酶抑制剂缺失减少了总体胶原密度，巨噬细胞在富含纤维蛋白区域的优先定位，加上纤维蛋白相关巨噬细胞程序的诱导和纤维蛋白在体外直接极化巨噬细胞，表明纤维蛋白作为免疫调节支架，保留和编程癌细胞周围的巨噬细胞。

与纤溶酶原激活-纤维蛋白调控轴的关系

• 研究结果增加了越来越多的证据，将纤溶酶原激活-纤维蛋白调控轴与PDAC免疫抑制联系起来。
• 最近的工作识别缺氧CAFs作为PAI的主要来源，并显示基质PAI促进免疫抑制性巨噬细胞状态并限制抗肿瘤免疫。
• 总之，这些研究表明基质和恶性来源的PAI蛋白均贡献于以巨噬细胞为中心的免疫抑制。虽然基质PAI似乎通过CAF介导的微环境调控起作用，但数据识别肿瘤来源PAI和PAI2足以建立局部富含纤维蛋白的免疫排除生态位。

PDAC凝血系统激活

• PDAC以凝血系统显著激活为特征，贡献于患者发病率。
• 在所有恶性肿瘤中，PDAC表现出癌症相关静脉血栓栓塞的最高发病率之一，患者经常发生凝血病伴随血清PAI水平增加。
• 丝氨酸蛋白酶抑制剂先前已显示在癌症进展中起作用。然而，研究发现其促肿瘤贡献在适应性免疫压力下出现，表明对表达PAI的PDAC克隆的选择，导致PDAC相关凝血病，可能是免疫驱动的。

丝氨酸蛋白酶抑制剂表达的罕见性

• 值得注意的是，SERPINE1和SERPINB2的表达在人和小鼠PDAC中均限于少数恶性上皮细胞，这可能是对其在免疫压力消退时可能限制肿瘤生长的适应。
• 通过模拟这种低频率的原位混合实验，研究团队显示一小部分表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的细胞足以在 otherwise 免疫允许的肿瘤中恢复局部免疫抑制。
• 这些结果建立了一个原则，将瘤内异质性与空间免疫控制联系起来，表明免疫排除局部和主导地运作，而非与肿瘤组成成比例扩展，为罕见恶性状态如何对肿瘤生态系统施加不成比例的非细胞自主效应提供了机制框架。

组织修复的劫持

• 在组织修复过程中，富含纤维蛋白的临时基质招募和指导髓系细胞，同时促进基质激活。
• 这种生理过程似乎被表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的PDAC细胞劫持，以创建免疫抑制生态位，其中富含纤维蛋白的基质通过αMβ2整合素（CD11b-CD18）接合髓系细胞。
• 值得注意的是，纤维蛋白介导的巨噬细胞编程也涉及神经炎症和神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病，突出该机制的重要性。

TGFβ信号与丝氨酸蛋白酶抑制剂的反馈环路

• 数据表明SERPINE1和SERPINB2标记部分重现修复反应的肿瘤细胞状态。这包括促进髓系招募、ECM重塑和TGFβ信号的基因模块的表达。
• Perturb-map Multi-modal确立丝氨酸蛋白酶抑制剂作为这些程序的因果调控因子，Serpine1-KO和Serpinb2-KO癌细胞下调这些通路中的关键基因，包括Tgfβ成员和Thbs1（潜伏细胞外TGFβ1的激活剂）。
• TGFβ是另一个已建立的关键调控因子，调控TME、ECM沉积和抗PD-1耐药。
• 这表明Serpine1和Serpinb2可能不仅通过改变纤维蛋白稳态，还通过增强TGFβ依赖性免疫调节程序来抑制抗肿瘤免疫。
• Serpine1本身是TGFβ信号的转录靶标，提出了连接Serpine1和Serpinb2表达与TGFβ信号的正反馈环路的可能性。
• 在这个框架中，丝氨酸蛋白酶抑制剂缺失后Tgfβ1的协调减少因此将纤溶系统定位为ECM组织和免疫抑制信号的上游调控因子。

局限性

• Perturb-map筛选聚焦于 curated 肿瘤来源细胞外因子集，因此未捕获免疫排除的全部肿瘤内在或基质调控因子谱。
• 此外，分析通过纤维蛋白（原）积累和免疫表型的变化推断对纤溶酶原激活-纤维蛋白重塑通路的影响，但没有直接测量纤溶活性或tPA和uPA的相对贡献。
• 最后，由于扰动仅限于肿瘤细胞，研究没有直接解决基质或免疫来源serpin表达的贡献。

总结

• 研究结果表明Serpinb2和Serpine1通过协调调控纤溶酶原激活-纤维蛋白重塑轴和肿瘤内在转录程序塑造肿瘤生态系统。
• 通过控制ECM组成和局部免疫信号，这些因子促进以巨噬细胞为中心的免疫抑制并保护恶性细胞免受免疫清除。
• 靶向该通路可能提供双重机会增强免疫治疗，通过 dismantling 纤维蛋白依赖性免疫抑制生态位和防止抑制性巨噬细胞编程。
• 与此一致，富集PAI1（由SERPINE1编码）和PAI2（由SERPINB2编码）的人类PDAC表现出不良临床结局和免疫治疗耐药特征，突出两种丝氨酸蛋白酶抑制剂及其下游通路作为有前景的治疗靶点。

方法

细胞外肿瘤来源基因的选择和优先化

• 使用逐步过滤和优先化策略，整合单细胞转录组分析、蛋白质亚细胞定位注释、功能依赖性数据、基于结构域的功能注释和基于文献的 curation。
• 分析人类和小鼠PDAC的公开scRNA-seq数据集，定义恶性或癌前上皮群体，进行差异基因表达分析。
• 使用Compartments数据库获取蛋白质亚细胞区室注释，保留注释到富集术语“细胞外区域部分”的基因。
• 使用DepMap数据库中46种人类胰腺癌细胞系的CRISPR-Cas9依赖性评分排除预计会强烈损害肿瘤细胞活力的基因。
• 进行通路和结构域水平分析以表征候选池中的生物程序，并指导最终基因集的文献知情选择。

慢病毒载体构建和生产

• 使用Brie CRISPR文库选择靶向每个基因的sgRNA序列。
• 文库克隆使用核PC/CRISPR慢病毒载体，验证使用lentiCRISPR v2。
• 慢病毒载体生产使用HEK293T细胞和第三代慢病毒包装质粒。

细胞培养

• FC1245 PDAC细胞（KPC细胞）和8442 PDAC细胞（KC细胞）在DMEM中常规传代。
• 所有细胞系常规检测支原体污染，检测阴性。

离体BMDM培养

• 从C57BL/6J小鼠分离骨髓，使用M-CSF分化BMDMs。

纤维蛋白共培养测定

• KPC细胞在10-cm培养皿中培养4天，收集条件培养基。
• 12孔板用纤维蛋白包被，BMDMs在KPC条件培养基存在下接种。

小鼠实验

• 所有动物研究按照ARRIVE指南进行，并经Icahn School of Medicine at Mount Sinai的IACUC批准。
• 使用Cas9表达小鼠、Rag2-/-小鼠、C57BL/6J小鼠或NSG小鼠。
• 原位胰腺肿瘤通过将50,000 KPC或KC癌细胞移植到8-10周龄小鼠胰腺中生成。
• ICB治疗、PAI1抑制研究、巨噬细胞耗竭实验和CD18阻断实验按指定方案进行。

流式细胞术

• 对于细胞分选实验，贴壁细胞用0.05%胰蛋白酶-EDTA分离。
• 对于TME的流式细胞术 profiling，新鲜PDAC样品切碎并用肿瘤解离试剂盒酶消化。

CyTOF质谱流式

• 细胞悬液处理和CyTOF分析如前所述进行。

Western blot

• 细胞裂解使用RIPA缓冲液，蛋白质浓度使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒定量。

MICSSS

• 单切片多重免疫组化连续染色（MICSSS）按照先前描述的方案进行。

CyCIF

• FFPE组织切片按照先前描述准备和染色，进行循环免疫荧光。

Xenium空间转录组学和post-Xenium CyCIF

使用10x Genomics Xenium Custom Panel Designer设计定制Xenium基因面板。

Xenium测定工作流程按照制造商FFPE组织方案进行。

Post-Xenium循环免疫荧光在转录组成像后进行。

Masson三色染色和分析

使用Trichrome Stain Kit在5 μm厚FFPE组织切片上进行Masson三色染色。

肿瘤图像在Fiji中处理，使用Colour Deconvolution2插件分离胶原特异性染色。

DepMap分析

使用CRISPR（DepMap Public 25Q3+Score, Chronos）数据集，包括46种人类PDAC细胞系。

泛癌bulk RNA-seq分析

使用TCGA和GTEx项目数据，通过UCSC Xena Data Hubs访问。

免疫治疗患者生存分析

分析Motzer等人的bulk RNA-seq和临床数据，评估SERPINE1和SERPINB2表达对接受avelumab加axitinib治疗患者PFS的影响。

生存荟萃分析

分析来自多个数据集的bulk转录组和临床数据，评估SERPINE1和SERPINB2对PDAC患者总生存的影响。

小鼠scRNA-seq

新鲜肿瘤样品处理成单细胞悬液，使用Chromium平台进行scRNA-seq。

人类scRNA-seq分析

从GEO存储库获取原始计数矩阵，使用Scanpy处理。

人类空间转录组学

分析57个原发性PDAC肿瘤样本的空间转录组数据。

统计分析

使用GraphPad Prism 10或上述软件进行统计分析。

关键结论

Perturb-map空间功能基因组学：识别出早期基因驱动的局部免疫邻域重塑先于晚期空间克隆优势。

SERPINE1和SERPINB2作为主要调控因子：这些丝氨酸蛋白酶抑制剂促进富含纤维蛋白的ECM生态位稳定，空间上保留巨噬细胞并将其编程为免疫抑制状态，同时排除细胞毒性T细胞。

免疫逃逸机制：Serpinb2和Serpine1缺失在免疫competent小鼠中减缓肿瘤生长，但在Rag2-/-和NSG小鼠中加速生长，表明其促肿瘤效应依赖适应性免疫压力。

治疗机会：

Serpine1或Serpinb2的遗传缺失与抗PD-1协同，中位生存时间几乎翻倍。

PAI1抑制剂PAI-039与抗PD-1联合显著延长生存。

CD18阻断破坏αMβ2介导的巨噬细胞保留，增强抗PD-1活性。

人类PDAC保守性：SERPINB2和SERPINE1表达限于少数恶性细胞，与SPP1+/MARCO+巨噬细胞富集的免疫抑制生态位相关。这些细胞在basal-like PDAC中富集。

克隆混合实验：仅5%表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的细胞足以恢复局部免疫抑制，表明免疫排除局部和主导地运作，而非与肿瘤组成成比例扩展。

机制轴：SERPINE1和SERPINB2通过协调调控纤溶酶原激活-纤维蛋白重塑轴和肿瘤内在转录程序（包括TGFβ信号）塑造肿瘤生态系统。

临床意义：富集PAI1和PAI2的人类PDAC表现出不良临床结局和免疫治疗耐药特征，突出这些丝氨酸蛋白酶抑制剂及其下游通路作为有前景的治疗靶点。

生活很好，有你更好。