Nat. Struct. Mol. Biol. | 高变环区特征分析揭示抗体稳定性的序列决定因素

抗体的折叠稳定性和聚集倾向是其在科研与临床应用中的关键限制因素。尽管抗体通过其高变区（CDRs）实现广泛抗原识别，但这种序列多样性往往以牺牲结构稳定性为代价。由于CDR区域序列极其多样且缺乏大规模数据，研究人员长期难以系统理解其对折叠的影响机制。

在本研究中，研究人员开发了一种高通量“深度环区特征分析”（deep loop profiling, DLP）方法，能够在数百万种CDR序列上量化抗体折叠能力。基于该数据训练的机器学习模型可以直接从序列预测折叠倾向，并揭示可解释的残基级规律。研究发现，CDR1和CDR2是决定抗体折叠稳定性的关键区域。

利用这些规律，研究人员成功修复了两个不稳定纳米抗体，包括一个易聚集的SARS-CoV-2结合抗体以及一个GPCR靶向胞内抗体，同时构建了具有优化物理性质的新一代合成抗体库。该研究为理解和工程化抗体稳定性提供了可扩展的技术框架。

抗体因其高度特异性，在生物医学领域中被广泛应用。然而，其功能依赖于良好的生物物理性质，例如稳定折叠和低聚集倾向。错误折叠或聚集会降低表达效率、影响功能，并在临床中带来安全风险。

纳米抗体作为传统抗体的替代形式，具有尺寸小、溶解性高以及可识别隐藏表位等优势，因此在膜蛋白、活性位点以及胞内靶点研究中表现突出。然而，即使纳米抗体整体结构较为稳定，其折叠能力仍存在显著差异。

近年来，合成抗体库通过控制CDR多样性，为抗体设计提供了重要平台。但研究人员发现，CDR多样性与折叠稳定性之间存在明显权衡关系。与此同时，传统结构预测与分子动力学方法在处理CDR区域时表现有限，因为这些区域具有高度柔性和序列多样性。

因此，理解CDR序列如何影响抗体折叠，不仅是基础科学问题，也直接关系到抗体工程与药物开发。

方法

研究人员提出了一种名为“深度环区特征分析”（DLP）的高通量实验与计算框架。该方法通过构建一个具有极高多样性的纳米抗体库，并在酵母表面展示这些抗体，从而实现对其折叠能力的系统评估。

具体而言，研究人员首先从天然骆驼来源的抗体序列中提取CDR的氨基酸分布规律，并据此设计了一个包含超过10⁹规模的合成纳米抗体库。随后，通过酵母展示系统表达这些抗体，并结合热变性实验与特异性抗体探针，区分折叠良好与折叠受损的变体。

研究人员进一步定义了“折叠适应度”指标，用于量化抗体在高温处理前后的稳定性差异。基于这些数据，构建了大规模训练集，并训练多种机器学习模型，包括逻辑回归和卷积神经网络，用于从序列预测折叠能力。

图1：DLP实验流程与纳米抗体库设计。

结果

大规模CDR折叠能力测定

通过DLP方法，研究人员在数百万CDR序列上测量了抗体折叠能力。实验结果显示，抗体折叠适应度呈现双峰分布，表明序列可分为“稳定折叠”和“易失活”两类。

此外，折叠适应度与再折叠能力和聚集倾向显著相关，但与传统的热稳定性指标（Tm）相关性较弱，说明折叠能力反映的是更复杂的生物物理特性。

图2：酵母展示系统与折叠适应度分布。

机器学习模型预测能力

基于实验数据训练的模型能够高精度预测抗体折叠能力。其中，卷积神经网络表现最佳，预测性能显著优于传统聚集预测工具。

更重要的是，这些模型不仅能区分高低适应度序列，还能对连续折叠能力进行定量预测，从而为抗体设计提供实用工具。

研究人员还发现，仅使用CDR1和CDR2信息即可达到接近全模型的预测性能，表明这两个区域在折叠中起主导作用。

折叠规则的结构可解释性

通过分析模型参数，研究人员提取了残基级别的“折叠规则”。结果显示：

整体趋势上，疏水残基降低折叠稳定性，而带负电残基有助于提高稳定性。

在CDR2中，较短环长度更有利于折叠，而较长环（尤其含色氨酸）则降低稳定性。

在CDR3中，某些关键位点（如106和117）通过与框架区域形成稳定相互作用，从而增强折叠能力。

这些结果揭示了抗体在“结构稳定性”和“抗原识别能力”之间的本质权衡关系。

图3：CDR残基层级折叠适应度热图。

不稳定抗体的结构修复

研究人员利用模型预测结果，对一个易聚集的SARS-CoV-2纳米抗体进行优化。通过引入少量突变，该抗体的折叠能力显著提升，同时保持其抗原结合能力。

实验验证表明，多位点突变组合能够显著改善再折叠能力并降低聚集倾向，证明模型具有实际工程应用价值。

胞内抗体稳定性优化

进一步研究中，研究人员将该方法应用于GPCR靶向胞内抗体。原始抗体在细胞内表达不稳定，而优化后的版本表现出更高表达水平、更低聚集以及更强的功能信号。

此外，优化抗体在细胞器定位实验中表现出正确的亚细胞分布，说明其不仅结构稳定，还具备生物学功能。

图4：胞内抗体优化与功能验证。

新一代抗体库设计

基于模型预测能力，研究人员设计了新的抗体库，通过筛选高适应度CDR序列组合，构建出整体稳定性更高的分子集合。

实验结果表明，新设计的抗体库在平均折叠能力上显著优于原始库，证明该方法可用于指导大规模抗体工程设计。

图5：高适应度抗体库设计与性能对比。

讨论

本研究提出了一种结合高通量实验与机器学习的抗体工程新范式，通过系统分析CDR序列空间，揭示了抗体折叠稳定性的关键决定因素。

研究人员认为，该方法的核心优势在于其可扩展性和可解释性。通过直接从大规模数据中学习序列–结构关系，模型能够捕捉传统方法难以描述的复杂规律。同时，逻辑回归模型提供了直观的残基级解释，使其不仅是预测工具，也成为机制解析工具。

研究还揭示了抗体设计中的基本矛盾：CDR区域需要高度灵活以识别多样抗原，但这种灵活性会降低折叠稳定性。未来抗体设计需要在这两者之间实现更精细的平衡。

尽管如此，该方法仍存在一定局限，例如主要基于体外系统，尚未完全考虑细胞环境对折叠的影响。此外，模型目前主要关注局部序列特征，未来可以结合结构与多模态数据进一步提升性能。

总体而言，本研究为抗体稳定性预测与工程设计提供了一个强有力的工具，并为开发更稳定、更高效的抗体药物奠定了基础。

整理 | DrugOne团队

参考资料

Wan, Y., Liang, J., Dai, Y. et al. Hypervariable loop profiling decodes sequence determinants of antibody stability. Nat Struct Mol Biol (2026).

https://doi.org/10.1038/s41594-026-01804-9