免疫组库基础分析14：基于NAIR包的TCR/BCR免疫组库公共簇分析

三兔测序学社

发布于 2026-04-17 16:49:55

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摘要：适应性免疫受体库测序（AIRR-Seq）是解析免疫应答、疾病标志物筛选的核心技术，TCR/BCR簇的跨样本共享性是关键研究切入点。NAIR（Network Analysis of Immune Repertoire）是基于R语言的免疫组库网络分析工具包，可高效实现公共TCR/BCR簇挖掘。

关键词：NAIR包；TCR/BCR；免疫组库；公共簇；网络分析

一、引言

T细胞受体（TCR）与B细胞受体（BCR）是适应性免疫的核心分子，其CDR3区序列多样性决定了抗原识别特异性。

在群体水平，公共簇指跨多个体/时间点共享、CDR3氨基酸序列差异≤1的相似克隆集合，反映保守免疫应答特征；

传统免疫组库分析侧重序列丰度与多样性，难以捕捉克隆间的相似性网络。

NAIR包基于图论与网络分析，将克隆视为节点、序列相似性视为边，通过聚类算法挖掘功能相关的受体簇，解决了多样本整合分析与表型关联挖掘的痛点。

二、环境配置与数据准备

2.1 包安装与加载

NAIR包托管于GitHub，需通过devtools安装，依赖igraph、tidyverse等基础包

# 安装NAIR包
install.packages("NAIR")
#
#第二种方式下载
devtools::install_github(
  "mlizhangx/Network-Analysis-for-Repertoire-Sequencing-",
  dependencies = TRUE, 
  build_vignettes = TRUE
)
# 加载包
library(NAIR)
set.seed(42) # 固定随机数，保证结果可复现

2.2 模拟测试数据

为避免真实数据限制，本文使用NAIR内置的simulateToyData()函数生成模拟AIRR-Seq数据，包含30个样本、每个样本30条序列，部分序列设计为跨样本共享，适配公共簇分析；后续关联簇分析将数据分为对照组与处理组，模拟表型关联数据。

2.2.1 公共簇分析模拟数

数据输出包含CloneSeq（CDR3序列）、CloneCount（克隆计数）、CloneFrequency（克隆频率）、SampleID（样本ID）四列，符合AIRR-Seq标准格式。

set.seed(42)
library(NAIR)
data_dir <- tempdir()
dir_input_samples <- file.path(data_dir, "input_samples")
dir.create(dir_input_samples, showWarnings = FALSE)
samples <- 30
sample_size <- 30 # (seqs per sample)          
base_seqs <- c(
  "CASSIEGQLSTDTQYF", "CASSEEGQLSTDTQYF", "CASSSVETQYF",
  "CASSPEGQLSTDTQYF", "RASSLAGNTEAFF", "CASSHRGTDTQYF", "CASDAGVFQPQHF",
  "CASSLTSGYNEQFF", "CASSETGYNEQFF", "CASSLTGGNEQFF", "CASSYLTGYNEQFF",
  "CASSLTGNEQFF", "CASSLNGYNEQFF", "CASSFPWDGYGYTF", "CASTLARQGGELFF",
  "CASTLSRQGGELFF", "CSVELLPTGPLETSYNEQFF", "CSVELLPTGPSETSYNEQFF",
  "CVELLPTGPSETSYNEQFF", "CASLAGGRTQETQYF", "CASRLAGGRTQETQYF",
  "CASSLAGGRTETQYF", "CASSLAGGRTQETQYF", "CASSRLAGGRTQETQYF",
  "CASQYGGGNQPQHF", "CASSLGGGNQPQHF", "CASSNGGGNQPQHF", "CASSYGGGGNQPQHF",
  "CASSYGGGQPQHF", "CASSYKGGNQPQHF", "CASSYTGGGNQPQHF", 
  "CAWSSQETQYF", "CASSSPETQYF", "CASSGAYEQYF", "CSVDLGKGNNEQFF") 
# relative generation probabilities
pgen <- cbind(
  stats::toeplitz(0.6^(0:(sample_size - 1))),
  matrix(1, nrow = samples, ncol = length(base_seqs) - samples))
simulateToyData(    
  samples = samples, 
  sample_size = sample_size,
  prefix_length = 1, 
  prefix_chars = c("", ""),
  prefix_probs = cbind(rep(1, samples), rep(0, samples)),
  affixes = base_seqs, 
  affix_probs = pgen, 
  num_edits = 0,
  output_dir = dir_input_samples, 
  no_return = TRUE
)
# View first few rows of data for sample 1
head(readRDS(file.path(dir_input_samples, "Sample1.rds")))
#>           CloneSeq CloneFrequency CloneCount SampleID
#> 1 CASSIEGQLSTDTQYF     0.02606559       2832  Sample1
#> 2 CASSEEGQLSTDTQYF     0.03718396       4040  Sample1
#> 3      CASSSPETQYF     0.03182726       3458  Sample1
#> 4 CASSIEGQLSTDTQYF     0.04615781       5015  Sample1
#> 5      CAWSSQETQYF     0.06006498       6526  Sample1
#> 6 CASSEEGQLSTDTQYF     0.03363123       3654  Sample1

三、公共TCR/BCR簇分析全流程

公共簇分析核心是先单样本筛选显著簇，再整合构建全局网络，分为3个核心步骤：单样本簇筛选、全局公共簇网络构建、下游可视化与分析。

3.1 步骤1：单样本显著簇筛选（findPublicClusters）

该函数为每个样本构建免疫组库网络，按节点数、克隆数过滤显著簇，输出元数据用于后续分析。

3.1.1 核心参数说明

input_files：样本文件路径向量
input_type：输入文件格式（rds/rda/csv/tsv）
seq_col：序列列名（本文为CloneSeq）
count_col：克隆计数列名（本文为CloneCount）
min_node_count：簇最小节点数（默认10）
min_clone_count：簇最小总克隆数（默认100）
output_dir：输出目录
The min_seq_length：序列最小长度
drop_matches ：排除字符类型

3.1.2 可运行代码

# 创建输出目录
dir_filtered_samples <- file.path(data_dir, "filtered_samples")
# 单样本簇筛选
findPublicClusters(input_files, 
                   input_type = "rds",
                   seq_col = "CloneSeq", 
                   count_col = "CloneCount",
                   min_seq_length = NULL, 
                   drop_matches = NULL,
                   top_n_clusters = 3, 
#默认top
 20
                   min_node_count = 5, 
                   min_clone_count = 15000,
                   output_dir = dir_filtered_samples
)
# 查看输出文件
list.files(dir_filtered_samples)
#> [1] "cluster_meta_data" "node_meta_data"
# 节点元数据（步骤2输入文件）
dir_filtered_node <- file.path(dir_filtered_samples, "node_meta_data")
head(list.files(dir_filtered_node))

输出两个子目录：cluster_meta_data（簇水平元数据）、node_meta_data（节点水平元数据），仅需node_meta_data用于全局网络构建。

3.2 步骤2：全局公共簇网络构建（buildPublicClusterNetwork）

合并所有样本的显著簇，构建全局网络，重新聚类得到公共簇，同时生成可视化图像。

3.2.1 核心参数说明

file_list：步骤1输出的节点元数据文件路径
seq_col/count_col：与步骤1保持一致
dist_type：序列距离算法（默认hamming，汉明距离）
dist_cutoff：距离阈值（默认1，CDR3差异≤1）
print_plots：是否打印网络图像

3.2.2 可运行代码

# 获取节点元数据文件路径
 dir_filtered_samples_node <- file.path(dir_filtered_samples, "node_meta_data")
# Vector of file paths to node metadata from step 1
files_filtered_samples_node <- 
  list.files(dir_filtered_samples_node, full.names = TRUE)
#>files_filtered_samples_node 文件向量结果如下（部分文件展示）
#>[1] "F:/NAIR/findpublicclusters/filtered_samples/node_meta_data/1_Sample1.rds" 
#>[2] "F:/NAIR/findpublicclusters/filtered_samples/node_meta_data/10_Sample10.rds"
#>[3] "F:/NAIR/findpublicclusters/filtered_samples/node_meta_data/11_Sample11.rds
# 构建全局公共簇网络
public_clusters <- buildPublicClusterNetwork(
files_filtered_samples_node,
seq_col = "CloneSeq", 
count_col = "CloneCount",
size_nodes_by = 1,
print_plots = TRUE
)

3.3 步骤3：结果解析与下游分析

3.3.1 输出结果结构

# 查看输出对象结构
 names(public_clusters) 
# 节点元数据（每个节点对应一个克隆）
 node_data <- public_clusters$node_data 
head(node_data[, c("CloneSeq", "SampleID", "ClusterIDInSample", "ClusterIDPublic")])
# 簇元数据（每个簇的网络属性） 
cluster_data <- public_clusters$cluster_data head(cluster_data[, 1:6]

ClusterIDInSample：单样本内部簇ID

ClusterIDPublic：全局公共簇ID

网络属性：节点度、中介中心性、聚类系数等

3.3.2 簇标注与单簇可视化

# 标注全局最大6个簇的ID
public_clusters <- labelClusters(
  public_clusters,
  cluster_id_col = "ClusterIDPublic",
  top_n_clusters = 6,
  size = 7
)
# 查看标注后的图像
public_clusters$plots[[1]]
# 单独分析1号公共簇
buildNet(
public_clusters$node_data[public_clusters$node_data$ClusterIDPublic == 1, ],
seq_col = "CloneSeq", 
color_nodes_by = "CloneSeq", 
size_nodes_by = 3, 
output_name = "Cluster 1",
print_plots = TRUE
)

四、核心参数调优与注意事项

4.1 序列距离算法选择

汉明距离（hamming）：默认，适合氨基酸序列，计算速度快，要求序列长度一致。
莱文斯坦距离（lev）：适合核苷酸序列，支持长度差异，计算成本高。

4.2 距离阈值设置

公共簇默认dist_cutoff=1，即CDR3序列仅1个氨基酸差异，符合免疫组库共识。
研究保守序列可设为0（完全匹配），研究广谱相似簇可设为2。

4.3 聚类算法替换

默认使用igraph::cluster_fast_greedy()，可通过cluster_fun参数替换：

# 替换为Louvain算法
buildPublicClusterNetwork( file_list = files_filtered_node, seq_col = "CloneSeq",  cluster_fun = igraph::cluster_louvain # Louvain聚类 )

4.4 输入数据要求

每个样本独立存储为rds/csv等格式，列名统一。
必须包含序列列，克隆计数列为可选（用于丰度过滤）。
序列不含*、_、|等非法字符，可通过drop_matches参数过滤。

参考文档：https://mlizhangx.github.io/Network-Analysis-for-Repertoire-Sequencing-/articles/public_clusters.html

免疫组库分析合集

【生信分析】免疫组库基础分析1-V/D/J基因使用频率计算

【生信分析】免疫组库基础分析2-V/D/J基因使用频率可视化图

【生信分析】免疫组库基础分析3-基于V/D/J使用频率的聚类分析

【生信分析】免疫组库基础分析4-VJ/VDJ组合使用频率计算及可视化

【生信分析】免疫组库基础分析5-多样性分析及其指数计算公式

【生信分析】免疫组库基础分析6-克隆子的分布分析（优势克隆与罕见克隆）

【生信分析】免疫组库基础分析7-CDR3长度分析

【生信分析】免疫组库基础分析8-CDR3氨基酸使用频率

【生信分析】免疫组库基础分析9-CDR3 motif分析

【生信分析】免疫组库基础分析10-CDR3 氨基酸理化性质分析

免疫组库分析11：Alakazam包【基因使用、多样性及氨基酸理化性质分析】使用说明

免疫组库分析12：TCR、BCR序列相似性网络分析-NAIR包介绍(1)

免疫组库基础分析13：TCR\BCR序列相似性网络分析_NAIR包介绍(2)

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