知识扩展--细胞衰老

作者，Evil Genius

在昨天的文章中，Xenium文献分享--心室辅助装置减负荷可逆转单心室疾病中的微血管衰老, 提到了疾病中的细胞衰老，那么在肿瘤微环境中，细胞衰老又有什么影响？肿瘤细胞会衰老么？

查阅了一些文献，其中有两篇文章很有价值。

两篇文章读完，对细胞衰老会有一个相对完整的认识。

那么细胞衰老在单细胞空间研究中的作用是什么？

今天我们来看看这部分内容

知识积累

细胞衰老是一种由应激诱导的、导致稳定细胞周期停滞的程序，是肝脏老化、纤维化和癌症的标志。

衰老由端粒缩短、DNA损伤、氧化应激和致癌信号等压力因素触发，其特征是形态和功能的改变，包括细胞体积增大、细胞核变化、代谢重塑以及衰老相关分泌表型。衰老相关分泌表型包含促炎性细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶，它们能够重塑组织微环境，促进慢性炎症和与年龄相关的疾病。衰老过程由肿瘤抑制通路 p53-p21CIP1 和 p16INK4a-Rb 驱动，其中 CDKN2A 和 CDKN1A 是典型的衰老标志物。

虽然衰老最初可能保护细胞免受损伤，但它最终会导致肝功能和再生能力受损。

结果1、正常和癌症肝组织队列的临床和多组学特征分析

scRNA + visium + xenium 5k。

样本来源：作为SenNet联盟的一部分，从Barnes-Jewish医院接受腹部手术的患者中收集了95例肝脏样本。

临床评估：获取了完整的临床元数据，并由病理学家对H&E和三色染色切片进行纤维化、脂肪变性和炎症的评分。

多组学筛选：在89例含有肝实质的样本中，有43例被用于后续多组学分析。

结果2、衰老肝细胞的丰度与年龄和肝脏疾病相关

衰老肝细胞亚群的识别

数据基础：从34例非癌肝脏供体的snRNA-seq数据中分离出64,263个肝细胞。为消除供体特异性代谢差异，使用Harmony算法进行整合聚类。

主要亚群：识别出多个推定衰老肝细胞群：

PS-Hep（CDKN1A+ SERPINE1+）：高表达CDKN1A（p21）和SERPINE1。

PS-Hep（CDKN1A+）：表达CDKN1A及NFKB1、CCL2、CXCL8等SASP相关因子。

CRP+肝细胞：高表达C反应蛋白，提示炎症状态。

分子与代谢特征

代谢重编程：CDKN1A+衰老肝细胞的脂质和异物代谢功能降低；而CDKN1A+ SERPINE1+衰老肝细胞的酒精代谢活性增强，类似于分区2-3区的肝细胞。

衰老相关通路激活：所有衰老肝细胞群均表现出SenMayo基因集、Fridman衰老基因集及TP53靶向通路的活性增加。

转录调控因子：snATAC-seq显示，CDKN1A+和SERPINE1+群体中AP-1（FOS/JUN）和NFKB1的基序 accessibility 增加；CRP+肝细胞则表现为STAT1和STAT3的活性升高。

临床相关性分析

与年龄相关：PS-Hep（CDKN1A+ SERPINE1+）在老年个体中的比例显著高于年轻个体（4.7% vs 1.7%）。

与纤维化相关：PS-Hep（CDKN1A+）在纤维化肝脏中显著富集。

个体特异性：CRP+肝细胞具有高度患者特异性，在急性肝损伤、败血症或未明确肝病病例中比例异常升高。

总结一下就是：在人肝脏中鉴定出了推定衰老肝细胞，其特征是表达CDKN1A、AP-1和NFKB1活性增强，并且与年龄和肝脏病理相关。

衰老肝细胞的细胞形态和定位

形态学特征：细胞核显著增大

核体积增加：在所有检测病例中，PS-Hep（CDKN1A+ SERPINE1+）的细胞核显著大于正常肝细胞，增幅达6%-14%。

疾病状态下的增大：在纤维化评分较高的病例中，这些衰老肝细胞的胞体也显著增大（增幅7%-13%），证实了体内衰老细胞的形态改变。

空间分布模式：非随机聚集与分区偏好

形成细胞cluster：共现分析显示，PS-Hep（CDKN1A+ SERPINE1+）并非随机分布，而是倾向于彼此相邻，形成空间簇，且在老年供体中这一聚集现象更为明显。

门静脉周围富集：在年轻个体中，CDKN1A+肝细胞优先定位于门静脉周围区域（距离<100-150 μm）。但当衰老细胞比例超过15%时，这种富集模式减弱，提示衰老可能向其他区域扩散。CODEX数据也验证了p21+肝细胞在门静脉周围的富集及其随年龄增长而增加的趋势。

潜在分子介导机制

候选分子筛选：通过整合snRNA-seq和Xenium数据，识别出可能与衰老细胞聚集相关的分子：

SERPINE1：衰老肝细胞自身的标志物，同时也是已知的衰老介质。

CLDN1：可能增强肝细胞间的粘附，促进细胞簇的形成。

THBS1-SDC4轴：衰老肝细胞和成纤维细胞表达的THBS1，可与衰老肝细胞上的SDC4相互作用，暗示旁分泌信号在维持衰老细胞簇中的作用。

聚集vs.孤立细胞差异：与孤立细胞相比，聚集的衰老肝细胞中CXCL2、IGFBP2和SDC4表达上调，进一步提示支持空间聚集的分子机制。

微环境变化趋势

细胞组成趋势：在衰老肝细胞簇周围，观察到肝星状细胞和炎性巨噬细胞含量增加、非炎性巨噬细胞含量减少的趋势，以及存在成纤维细胞衰老表型，提示衰老可能在局部微环境中通过旁分泌方式传播。

总结：推定衰老肝细胞表现出细胞核增大、在空间上聚集在一起，并且可能首先出现在门静脉周围，然后扩展到肝脏内的其他区域。

结果3、肝内衰老成纤维细胞的双重来源

衰老成纤维细胞的识别与特征

细胞来源：从单核RNA测序数据中分析6,082个间充质细胞，重点关注5,033个肝星状细胞和门静脉成纤维细胞。

独特群体：识别出一个独特的推定衰老成纤维细胞群体，其特征在于：

标志物：表达CDKN1A和CCL2。

SASP特征：高表达CCL2、SERPINE1、IL6等衰老相关分泌表型因子，SenMayo评分升高。

转录调控：snATAC-seq显示AP-1、C/EBP和NF-κB基序的开放性增加，且CCL2增强子区域开放。

功能通路：富集凋亡调控、TNF应答及细胞外基质组织等相关通路。

形态：细胞核较门静脉成纤维细胞增大。

蛋白验证：CODEX数据证实p21+成纤维细胞中CCL2蛋白表达水平更高。

临床关联：与肝纤维化密切相关

丰度增加：PS成纤维细胞和活化HSC在纤维化肝脏供体中更丰富。

相关性：PS成纤维细胞与活化HSC的比例呈正相关，尤其在中期纤维化阶段更为明显，提示二者可能存在调控联系。

双重细胞起源

轨迹分析：通过Monocle 3等轨迹推断方法，发现PS成纤维细胞有两个起源：

主要来源：门静脉成纤维细胞。

次要来源：静止期和活化期的肝星状细胞。

起源特异性基因：

门静脉成纤维细胞来源：上调ADAMTS9、LMNA、SERPINE1、TNC、VMP1。

肝星状细胞来源：上调ACTA2、ETV6、IGFBP7、PALLD、TNC。

结论

肝脏中的衰老成纤维细胞是一类以CDKN1A/CCL2表达、SASP活性增强和核增大为特征的独特间充质群体。它们具有门静脉成纤维细胞和肝星状细胞双重起源，在纤维化肝脏中丰度增加，提示其在纤维化进展和衰老微环境的细胞外基质重塑中发挥潜在作用。

CDKN1A+管周内皮细胞和胆管上皮细胞与年龄及肝病相关

衰老胆管细胞的特征

两个亚群：

• PS-Chol（SASP）：表达趋化因子/细胞因子类SASP（CXCL1、CXCL6、CXCL8、CCL2）。
• PS-Chol（IGFBPs）：高表达IGFBP家族成员。
• 共性特征：两个亚群的SenMayo评分和TP53靶标评分均升高。
• 调控因子：PS-Chol（SASP）表现为AP-1和NF-κB活性增强；PS-Chol（IGFBPs）则表现为C/EBP基序活性增加。

形态与临床关联：

细胞核显著增大。

在老年个体中，该细胞占比可达胆管细胞总数的45%。

在纤维化病例中更常见。

衰老肝窦内皮细胞的特征

细胞类型：主要涉及两个小叶中部LSEC亚群。

PS-midLSEC（CDKN1A+）：

特征：表达CDKN1A，TP53/DNA损伤信号增强。

关联：主要与年龄相关，占比低（<6%）。

PS-midLSEC（CDKN1A+ CCL2+）：

特征：表达CDKN1A及SASP因子（IGFBP7、APP、COL4A1），AP-1（FOS/JUN）活性增强。

关联：与纤维化密切相关，占小叶中部LSEC的比例高达50%。

人类衰老细胞在小鼠纤维化肝脏中重现

模型：使用小肠切除术诱导的肠衰竭相关肝病小鼠模型，在术后2、10、26周收集肝脏样本进行分析。

目的：验证在人类肝脏中观察到的衰老细胞群是否在该疾病模型的小鼠体内重现。

主要细胞类型的衰老特征重现

肝细胞：观察到三类类似人类的衰老肝细胞群体——表达Serpine1的PS肝细胞、表达Cdkn1a的PS肝细胞，以及共表达Cdkn1a和Jun的PS肝细胞。这些细胞在SBR小鼠（尤其在纤维化后期）中的比例均高于假手术组。

成纤维细胞：存在显著的保守性。小鼠PS成纤维细胞表达Cdkn1a、Ccl2、Serpine1、Nfkb1、Fos、Jun和Igfbp7，与人类PS成纤维细胞的分子特征高度相似。在所有时间点的SBR小鼠中，该细胞比例均显著更高。

肝窦内皮细胞：检测到表达Cdkn1a和Ccl2的PS小叶中部LSECs，与人类PS LSECs类似。

胆管细胞：存在保守的衰老状态，特别是富含SASP的群体（表达Thf、Ccl2、Tgfb1），该群体在10周和26周的SBR小鼠中稳定增加。

结果4、空间生态位揭示纤维化相关细胞群落

分析方法：利用Xenium空间转录组数据，结合BANKSY算法和Harmony校正，在20个样本中识别出18个可重复的空间微环境。

微环境类型：根据细胞类型富集和标志物表达，将其分为：

肝实质区：区域1、2、3。

门静脉区。

免疫实质区。

纤维化相关的空间微环境动态

扩增的微环境：PT14（门静脉区的一个亚型）与纤维化的正相关性最强，该区域富集衰老成纤维细胞。其次是PY2（区域1）。

缩减的微环境：PY11（区域2）、PY15（区域3）和PT13与纤维化呈负相关。PT13富含正常门静脉结构的细胞（周细胞、血管平滑肌细胞、门静脉成纤维细胞）。

结论：纤维化进展伴随着门静脉区和肝实质区的差异性空间重塑。

衰老成纤维细胞-免疫细胞的通讯枢纽

核心配受体对：CXCL12-CXCR4轴。衰老成纤维细胞表达CXCL12，而T细胞和炎性巨噬细胞表达其受体CXCR4。

空间共定位：Xenium数据显示，衰老成纤维细胞与CXCR4+免疫细胞频繁发生物理接触。

跨物种保守性：在小鼠SBR模型中也验证了Cxcl12-Cxcr4信号通路的保守性，且在纤维化后期（26周）相互作用最强。

其他信号通路：衰老成纤维细胞还通过CXCL、胶原蛋白、腱生蛋白和THBS通路充当信号枢纽，表明衰老微环境中存在广泛的细胞外基质重塑。

衰老肝细胞特化的空间微环境

定位与特征：在Glisson囊下发现一个富集衰老肝细胞的微环境，高表达SERPINE1和SDC4。

相互作用轴：THBS1-SDC4轴。衰老成纤维细胞和活化HSC来源的THBS1信号，作用于衰老肝细胞上的SDC4受体，连接了衰老的基质细胞与上皮细胞。

空间转录组学揭示了纤维化肝脏中一个由衰老成纤维细胞和免疫细胞富集的门静脉微环境，其形成可能由ECM重塑和CXCL12-CXCR4信号驱动。同时，衰老肝细胞通过THBS1-SDC4轴与基质细胞通讯。这些发现阐明了衰老细胞如何通过协同作用建立并维持促炎和促基质重塑的微环境。

结果5、癌症加剧并扩大肝脏中的衰老细胞群体

癌症加剧现有衰老表型

丰度显著增加：与老年正常肝脏相比，mCRC肝脏中：

PS肝细胞（CDKN1A+ SERPINE1+ 和 CDKN1A+）的丰度增加 5倍。

PS小叶中部LSECs（CDKN1A+ CCL2+）的丰度增加 2.7倍。

转录组加剧：mCRC肝脏中的PS肝细胞和PS LSECs表现出更剧烈的转录组变化，而PS成纤维细胞和PS胆管细胞的转录组与正常衰老时相似。

癌症诱导新的衰老细胞群体

独特群体：在mCRC肝脏中发现了正常肝脏中不存在或极少见的衰老群体：

衰老肝祖细胞。

表达CDKN2A/CDKN2B的胆管细胞：占胆管细胞的~10%，表达独特的SASP因子（TNC、ITIH5、LAMC2、CXCL8、TGFB2）和转录因子活性。它们常定位于肿瘤床内，且其丰度在化疗与否的病例中无差异，提示可能是由肿瘤诱导而非化疗驱动。

化疗进一步增加衰老负担

剂量效应：未经治疗的mCRC肝脏衰老水平已高于正常肝脏，而接受化疗的病例衰老水平最高，且与累积化疗暴露量相关。

PS肝细胞丰度与患者无进展生存期无显著关联。

空间分布特征

肿瘤邻近效应：在年轻未治疗患者中，观察到肿瘤邻近区域的肝细胞出现衰老，表明肿瘤本身可诱导周围组织衰老。

门静脉周围富集：衰老肝细胞仍倾向于分布在门静脉周围，与正常肝脏一致。

肿瘤微环境中的衰老癌症相关成纤维细胞

两个CAF亚群：

CDKN2A/2B+ CAFs

CDKN1A+ SERPINE1+ CAFs：表达更多分泌型SASP因子，转录组与PS门静脉成纤维细胞相似。

转录调控：两个亚群均表现出AP-1/C/EBP活性，同时TEA结构域转录因子活性升高。

起源推测：轨迹分析提示CDKN1A+ SERPINE1+ CAFs可能起源于PS门静脉成纤维细胞。

空间定位：门静脉成纤维细胞和PS成纤维细胞位于肿瘤外部周围，而两种衰老CAF群体均位于肿瘤内部。

结论

癌症本身即可加剧肝脏中特定衰老细胞群体的扩增，并诱导新的衰老群体（如CDKN2A+胆管细胞）。化疗进一步加重了这一负担。肿瘤微环境中的衰老CAFs可能起源于门静脉区域的成纤维细胞，并在肿瘤内部重塑微环境。

结果6、衰老相关特征和相互作用的综合发现

衰老的协调性与临床特征

衰老细胞类型分组：分为衰老相关（PS肝细胞CDKN1A+ SERPINE1+、PS LSECs CDKN1A+）和纤维化相关（其他所有PS细胞类型）两大类。

“高衰老”供体群体：通过聚类分析，鉴定出一个“高衰老”供体组，其特点是老年、男性和肝纤维化富集，表明多种肝脏细胞类型的衰老是协同发生的。

性别差异：仅PS胆管细胞SASP在男性中显著更高，与男性肝病患病率更高一致。

共享的分子程序

核心转录因子：在至少三种衰老细胞群中上调的基因包括：

NFKB1：SASP调控因子。

KLF6和ATF3：参与p21调控和衰老建立。

抗应激与抗凋亡基因：SOD2和抗凋亡因子在多种衰老细胞中广泛升高。

肝脏SASP组成：

成纤维细胞和LSECs共享许多分泌蛋白（如COL4A1/2、ADAMTS4/9、SERPINE1）。

上皮来源的衰老细胞（肝细胞、胆管细胞）则具有独特的SASP组成。

细胞间通讯网络的加剧

总体变化：“高衰老”肝脏的细胞间通讯强度显著增加。

关键信号枢纽：PS成纤维细胞（CDKN1A+ CCL2+） 表现出最强的输出和输入相互作用增幅，与多种细胞类型发生通讯。

富集信号通路：

ECM组织（COLLAGEN、FN1）

粘附与迁移（OCLN、VTN、CLDN）

免疫调控（THBS、CD96）

THBS信号轴的核心作用：

衰老成纤维细胞来源的THBS1，通过CD47和CD36靶向巨噬细胞、T/NK细胞和内皮细胞，成为衰老微环境中免疫调节和抗血管生成信号的核心介质。

其他衰老促进信号：TNC和NAMPT在“高衰老”样本中富集。

保护性机制：PS肝细胞与CRP+肝细胞间的TNFSF14-LTBR信号差异，提示可能保护肝细胞免受TNF-α诱导的凋亡。

空间聚集机制：PS肝细胞间富集的CLDN信号可能解释其空间聚集现象。

跨物种保守性验证

人类验证：利用Xenium 5K数据在两个人“高衰老”样本中验证了20条富集的衰老相关互作通路，包括THBS1-CD47、THBS1-CD36和胶原蛋白-CD44。

小鼠验证：在SBR小鼠模型中，26周纤维化肝脏的THBS信号增幅最大。小鼠PS成纤维细胞同样作为Thbs1信号的主要来源，靶向表达Sdc1、Cd47和Cd36的接收细胞。

结论：THBS介导的衰老信号网络在物种间和疾病模型中具有高度保守性。

总结

该部分研究通过整合分析，揭示了肝脏衰老是一个涉及多细胞类型的协调过程，定义了核心的共享分子程序，并鉴定出以THBS信号轴为核心的保守细胞间通讯网络，为理解衰老微环境的形成机制提供了系统视角。

最后，来看看方法

Xenium 5k数据分析

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