单细胞空间突变--TP53相关组织重塑的细胞与空间图谱界定了肺腺癌中的多细胞肿瘤生态系统

作者，Evil Genius

不得不感叹命运弄人，人生轨迹已经严重偏离正常的方向。

对于肿瘤或者疾病样本，简单的肿瘤组（疾病组）vs对照组，或者肿瘤（疾病）病理的各个阶段作为分组，现在审稿人很难认同这样的做法，必须借助基因组的力量进行分子分型。

知识积累

肿瘤蛋白p53（TP53）是多种癌症中最常发生突变的基因，其突变与肺腺癌（LUAD）患者总生存期缩短相关。

基因组改变已被用于界定NSCLC的分子亚型，这些分型可为携带特定基因组改变的患者选择治疗方案。针对致癌突变和染色体重排（如EGFR、KRASG12C和ALK）的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）及其他靶向治疗，已显著提升NSCLC患者的生存率。免疫检查点抑制剂（ICI）（如抗PD1/PDL1）单药或联合化疗的治疗方案，在一部分参与者中也显示出临床获益，目前已被用作特定可切除与不可切除NSCLC患者的一线治疗。

肿瘤蛋白p53（TP53）是NSCLC（约50%的病例）及多种其他癌症中最常发生突变的基因。TP53突变在吸烟者中更为常见，且与肿瘤进展和转移相关，导致NSCLC患者生存期缩短。尽管作为被广泛研究的肿瘤抑制因子，TP53因其突变类型的多样性及其参与的调控通路广泛，一直难以成为治疗靶点。已知TP53在小鼠模型的肿瘤发展过程中会影响肿瘤微环境（TME），且在人类肺腺癌（LUAD）中，TP53突变与PDL1表达上调及对抗PD1疗法反应更佳相关，这促使深入探讨携带TP53突变型（TP53mut）与野生型（TP53WT）肿瘤的LUAD患者其TME的差异。

结果1、非小细胞肺癌多组学图谱

全外显子测序（WES）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组学分析（ST；10X Visium平台）及多重免疫荧光检测（mIF）。

相较于TP53WT型LUAD肿瘤，不同TP53突变在恶性细胞中均能类似地下调TP53靶基因的平均表达。

P53突变型LUAD具有独特的肿瘤微环境组成

TP53mut型LUAD中内皮细胞和周细胞比例显著下降.

单细胞空间联合，在ST数据spot中也观察到TP53mut型肿瘤样本的内皮细胞和周细胞比例低于TP53WT型，与scRNA-seq数据一致。

结果2、肺腺癌恶性细胞程序的双重活性与生存预后相关

TP53突变通过重塑肺腺癌的分子和细胞生态，驱动了更具侵袭性的肿瘤表型。其核心影响在于：一方面，它使肿瘤细胞丧失正常的肺泡特征（AT2身份），另一方面，则激活了一系列与细胞周期、糖酵解、部分上皮-间质转化（pEMT）和缺氧相关的促癌基因程序，这些程序均与患者较短的总体生存期显著相关。与此同时，TP53突变还塑造了一个独特的免疫抑制性肿瘤微环境（TME），其特征是内皮细胞和周细胞减少，并富集了SPP1+巨噬ages、胶原成纤维细胞以及多个免疫检查点分子（如PD-L1）的相互作用，这共同促进了肿瘤的进展与免疫逃逸，但也可能增强了对免疫检查点抑制剂治疗的敏感性。

结果3、不同类型的TP53突变及共突变模型中，研究人员观察到了一系列高度一致的癌症内在变化。

1. TP53突变的主导作用

无论是否存在EGFR或KRAS共突变，TP53突变本身都会导致TP53靶基因表达下降、AT2样特征丢失，以及细胞周期G2/M程序激活。

在糖酵解、缺氧和pEMT等恶性程序的上调中，TP53突变也起主导作用，而EGFR突变可能会削弱TP53在这些程序上的诱导效应。

2. 突变类型的一致性影响

不同类型的TP53功能缺失突变（如显性阴性DNE、功能丧失LOF和高影响力II类突变）均能引发上述恶性程序的一致改变。

这些变化在TP53野生型细胞系（A549）中过表达多种TP53突变变体后同样出现，表明它们是TP53野生功能丧失后的共同结果，而非特定突变的功能获得所致。

3. 从小鼠模型到人类数据的验证

在KP（KRAS突变+p53缺失）基因工程鼠的肺癌模型中，同样观察到AT2特征丢失以及细胞周期、缺氧、pEMT程序的激活，这与人类肿瘤中的数据高度一致。

值得注意的是，在体外细胞培养中并未观察到缺氧/pEMT程序的显著增强，提示肿瘤微环境对于这些恶性表型的完整形成至关重要。

4. 细胞可塑性与信号熵增加

TP53突变导致的一个核心变化是信号熵的显著增加，这是细胞可塑性提升的标志。

熵增在仅TP53突变或TP53-KRAS共突变的肿瘤中最为显著，并且在DNE、LOF和高影响力II类突变中表现最强。

在人类肿瘤中，细胞周期和pEMT程序显示出了最高的熵值，并且与小鼠模型中定义的高度可塑性细胞状态高度相似。

总结

TP53突变通过驱动肿瘤细胞丧失正常肺泡身份并获得高可塑性，一致性地激活了多种与不良预后相关的恶性程序。这种效应在不同突变类型、实验模型和分子层面（RNA/蛋白）均得到验证，确立了TP53突变在塑造肺腺癌侵袭性表型中的核心地位。

结果4、在TP53突变型肺腺癌中富集着抑制血管化并促进上皮-间质转化的基质相互作用

TP53突变通过重塑肿瘤基质微环境，共同抑制血管生成并促进上皮-间质转化（EMT），从而驱动更具侵袭性的肿瘤表型。其核心机制包括：

抑制血管化：

• 细胞组成改变：TP53mut肿瘤中负责气体交换的特定内皮细胞（如肺泡毛细血管和动脉内皮细胞）比例显著下降。
• 分子机制：富集了已知能抑制内皮细胞生长的配体-受体相互作用（如SEMA3A-NRP1和EPHB2-EFNB1），这些抑制性信号在空间上高度共定位，共同导致肿瘤血管功能不全和缺氧。

促进EMT与基质活化：

• 关键成纤维细胞亚群：鉴定出高表达胶原的CAF.COLs等癌症相关成纤维细胞（CAF）亚群，它们激活TWIST1等与EMT相关的基因程序。
• 信号通路富集：TP53mut肿瘤中，恶性细胞与间质细胞之间的TGF-β信号（如TGFB2-TGFBR2）空间关联性增强，这是已知的EMT强诱导信号。

总结：TP53突变通过协调一系列基质细胞在组成、互作和空间分布上的改变，共同营造了一个低氧、促转移的微环境，这为理解TP53突变肺腺癌更具侵袭性的临床预后提供了新的机制解释。

结果5、TP53突变如何影响髓系免疫细胞

TP53突变通过改变髓系细胞（尤其是肿瘤相关巨噬细胞TAMs）的组成和功能，驱动了一个更具免疫抑制性和促转移的微环境。其核心机制包括：

髓系细胞组成重塑：

• 关键亚群变化：在TP53mut肿瘤中，具有正常肺泡巨噬细胞特征的TAM.FABP4亚群比例下降，而高表达SPP1（骨桥蛋白）的TAM.SPP1亚群和分泌趋化因子的TAM.CXCLs亚群则显著增加。

促癌分子程序激活：

• SPP1的核心作用：SPP1的表达与较差的患者生存率相关，并且其表达与EMT、缺氧、糖酵解等恶性程序，以及血管内皮生长因子受体（如NRP1、FLT1）的表达紧密相连。
• 趋化因子释放：CXCL9/10/11 等趋化因子在TP53mut肿瘤中上调，这些分子能招募特定的免疫细胞。

关键的细胞间相互作用：

• 免疫细胞招募与分化：富集了VEGFA-FLT1/NRP1等相互作用，促进髓系细胞向肿瘤部位募集；TGFB2-TGFBR1信号则可能推动单核细胞向TAMs分化。
• 淋巴细胞调节：CXCL11-CXCR3相互作用的增加，可能通过CXCR3受体（在NK、B、T细胞上表达）来影响淋巴细胞的活性和定位。
• SPP1介导的广泛作用：SPP1与其受体（如CD44）的相互作用在髓系细胞与内皮细胞/周细胞之间增强，这连接了免疫调节与血管功能失调。

总结：TP53突变塑造了一个独特的髓系细胞区室，其特征是SPP1+ TAMs和CXCLs+ TAMs的扩增。它们通过分泌SPP1、CXCL11等因子，建立了一个促进EMT、缺氧、免疫细胞异常招募的微环境网络，共同推动了肿瘤的恶性进展和免疫逃逸。

结果6、Enrichment of T cell exhaustion and immune checkpoint interactions in TP53mut LUAD

TP53突变在肺腺癌（LUAD）中塑造了一个T细胞耗竭特征显著且免疫检查点相互作用富集的淋巴细胞环境，这反而可能预示着对免疫检查点抑制剂（ICI）治疗更佳的反应。核心发现包括：

淋巴细胞组成重塑：

• T细胞状态改变：TP53mut肿瘤中，具有抗肿瘤潜力的CD4+ 组织驻留记忆T细胞比例下降，而耗竭前体样 (CD8.GZMK) 和终末耗竭样 (T.Exhausted) T细胞的比例显著增加。

免疫抑制分子环境增强：

• 检查点分子高表达：多个T细胞亚群中，PDCD1 (PD-1)、CTLA4、HAVCR2 (TIM-3) 和 TIGIT 等关键免疫检查点分子的表达全面上调。
• 关键趋化因子：与ICI疗效正相关的CXCL13在耗竭T细胞和滤泡辅助T细胞中高表达，且在TP53mut肿瘤中表达更高。

免疫检查点相互作用富集：

• 细胞间互作：TP53mut肿瘤中，T细胞与恶性细胞之间的 PD-1/PD-L1 (PDCD1-CD274) 和 TIGIT/PVR 相互作用，以及T细胞与髓系细胞之间的 CTLA4/CD86 和 TIM-3/Gal-9 (HAVCR2-LGALS9) 相互作用均显著富集。
• 空间共定位：TIGIT 和其配体 PVR 在TP53mut肿瘤组织中的空间共定位程度更高。PVR在增殖中的恶性细胞上表达尤其高。

临床转化意义：

• 实验验证：多重免疫荧光在多个独立队列中证实，TP53mut肿瘤内有更多的PD-L1+肿瘤细胞和PD-1+CD8+ T细胞，并且两者之间的空间共定位更强。
• 生存获益：在接受抗PD-1等ICI治疗的晚期NSCLC患者中，携带TP53突变（尤其是DNE、LOF和高影响力II类突变）的患者，其无进展生存期显著更长。

总结：TP53突变在肺腺癌中创造了一个虽然免疫抑制但同时对免疫治疗更敏感的肿瘤微环境。其特征是T细胞耗竭程序增强和多个免疫检查点通路（特别是PD-1/PD-L1和TIGIT/PVR）的广泛激活。

结果7、TP53突变型肺腺癌中的低氧与上皮-间质转化程序

TP53突变型肺腺癌通过形成一个特定的多细胞生态位，在空间上协调并加剧了缺氧和上皮-间质转化（EMT） 程序。其核心发现如下：

独特的空间模式：

在TP53mut肿瘤中，内皮细胞与间质细胞、髓系细胞的空间共定位显著减少，这与观察到的血管减少和缺氧加剧现象一致。

关键的多细胞生态位：

通过非负矩阵分解识别出一个关键生态位 NMF7，它由SPP1+巨噬细胞、胶原蛋白高表达的成纤维细胞和肌成纤维细胞等促癌基质细胞高度共定位形成。

该生态位富含缺氧和EMT程序的表达信号，并且主要位于肿瘤核心的外围区域。

实验验证：

多重免疫荧光实验证实了SPP1+巨噬细胞与α-SMA+成纤维细胞在空间上形成多细胞生态位。

同时验证了在TP53mut肿瘤中，SPP1+巨噬细胞附近的内皮细胞数量更少，直观地解释了血管化不足和缺氧的成因。

总结：TP53突变驱动了一个由特定巨噬细胞和成纤维细胞构成的免疫抑制性基质生态位在肿瘤外围形成。这个生态位在空间上通过破坏血管结构、加剧缺氧，并直接激活EMT程序，共同推动了肿瘤的侵袭性进展。这从空间维度揭示了TP53突变促进肿瘤恶性演化的新机制。

最后来看看方法

WES部分

单细胞部分

cNMF

visium部分

生活很好，有你更好。