基于成像空间转录组技术的肿瘤亚克隆CNV原位推断方法

2025年7月2日 bioRxiv预印了一篇文章 In Situ Inference of Copy Number Variations in Image-Based Spatial Transcriptomics 提出iST-CNV方法，实现了从iST数据中推断CNV，并系统评估了技术限制与临床应用潜力。

引言：CNV与肿瘤研究的挑战

拷贝数变异（CNV）作为癌症驱动因素，在肿瘤异质性和治疗抵抗中起关键作用。传统基于测序的空间转录组技术（sST）虽能解析CNV，但受限于分辨率低（多为多细胞混合spot）和检测效率不足，难以实现单细胞精度的肿瘤克隆空间定位。近年来，成像空间转录组（iST，如CosMx、Xenium）凭借高分辨率（单细胞水平）和原位保留空间信息的能力崭露头角，但其基因覆盖度有限（通常数百至数千基因），CNV推断一直未被突破。

方法创新：RNA velocity启发的信号增强策略

1. 算法核心思想

该算法受RNA velocity模型中"细胞邻域信息传递"的启发，通过加权平均细胞及其邻近细胞的表达谱，增强低丰度基因信号并降低技术噪声。其核心假设是：

空间或转录组邻近的细胞可能处于相似的生物学状态，共享相似的CNV模式。

2. 数学建模与实现步骤

(1) 邻域图构建

• 输入数据：单细胞/空间表达矩阵（基因×细胞），通常已进行基础归一化和log转换
• 邻域定义：
  • 基于k近邻图（k-NN graph）或空间距离（针对iST数据）
  • 距离度量：余弦相似度（转录组相似性）或欧氏距离（物理空间邻近性）
  • 示例参数：CRC研究中使用100个转录组邻居（k=100）

(2) 权重计算

邻域细胞j对目标细胞i的贡献权重 ( w_{ij} ) 通过以下方式确定：

• 转录组相似性权重：其中 ( d_{ij} ) 是细胞i与j的表达谱距离，γ为衰减系数（默认γ=1）
• 空间距离权重（可选）： 对iST数据可额外引入空间衰减因子，如高斯核函数：（( x_i )为细胞i的空间坐标，σ控制衰减范围）

(3) 表达谱平滑

目标细胞i的平滑后表达值 ( M_i ) 计算为：

其中 ( X_j ) 为邻域细胞j的归一化表达向量。实际操作中：

• 稀疏性处理：对零计数基因采用伪计数填充（如+1）
• 迭代平滑：可重复2-3次以增强信号（但需避免过度平滑）

(4) 下游CNV推断

平滑后的矩阵 ( M ) 输入至改进版inferCNVpy，关键调整包括：

• 参考细胞选择：使用病理注释的正常区域细胞或非上皮细胞作为基线
• 动态阈值：针对CNV增益（gain）和缺失（loss）分别设置截断值（如|LFC|>0.1）

3. 生物学与技术优势

(1) 解决iST数据痛点

• 低检测效率：CosMx平均仅973 counts/细胞，传统方法信噪比低
• 基因覆盖有限：即使WTx面板（~20k基因），单个基因仍稀疏
• 空间信息保留：避免解离式单细胞测序的空间信息丢失

(2) 与RNA速度的关联

• 共同理论基础：均利用细胞状态连续变化的假设（但RNA velocity关注剪切动力学，此处关注CNV稳定性）
• 关键差异：维度RNA速度模型CNV平滑模型动态类型转录瞬时变化（u/s RNA）基因组结构变异（长期稳定）时间尺度分钟至小时级克隆进化（月/年级）输入数据需未剪切/剪切mRNA仅需成熟mRNA

4. 技术验证：性能评估与关键发现

1. 双平台一致性验证

研究团队对结直肠癌（CRC）配对样本分别进行CosMx iST和单核PATHO-seq（snPATHO-seq）分析，结果显示：

• CNV图谱高度一致：均检测到CRC典型变异（如13q增益、8p缺失），且恶性亚克隆空间分布与病理注释（腺瘤/癌变区域）吻合（Dice系数0.837）。
• 三克隆进化模型：发现3个CNV定义的上皮亚克隆，其中一簇富集于晚期腺瘤（TVA3），提示早期肿瘤进展。

2. 技术限制的系统评估

通过模拟63种数据场景（不同基因面板大小、检测效率），揭示关键性能边界：

• 基因面板阈值：<1000基因的panel无法有效预测CNV（AUC<0.7），而≥2000基因时性能饱和（图2c）。
• 检测效率：CNV增益预测在1000 counts/细胞时达平台期，而缺失预测始终较差（AUC<0.8），可能与低表达基因的噪声有关。
• CNV大小影响：大片段CNV（10-20 Mb）比小片段（1-5 Mb）更易检测（F1-score提升30%）。

3. 卵巢癌的空间微环境解析

在高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的Xenium数据中：

• 克隆-微环境互作：4个主要CNV亚克隆（占95.7%细胞）呈现空间区室化，其中克隆1/3周围富集T/B细胞，克隆0/2则与成纤维细胞共定位（与早期复发相关）。
• 临床关联性：8q24扩增（已知卵巢癌驱动因子）被精准检出，验证了方法的生物学相关性。

技术局限性

1. 检测灵敏度边界

• 基因面板依赖： <1000基因面板的CNV预测近乎随机（AUC<0.7），500基因面板完全失效
• 计数深度限制： CNV增益检测需≥1000 counts/细胞，缺失检测始终较差（AUC<0.8）
• CNV大小影响： 1-5 Mb小片段检出率比10-20 Mb大片段低30%（F1-score）

2. 生物学复杂性挑战

• 肿瘤异质性 稀有亚克隆（<5%细胞占比）检测困难，算法倾向于识别主导克隆
• 基质干扰 肿瘤纯度<50%时准确性下降30%，需联合病理注释优化参考细胞选择

总结

本研究首次证明iST数据可用于CNV推断，填补了单细胞空间基因组学的技术空白。其提出的平滑-聚类-空间映射流程为肿瘤异质性研究提供了新工具，尤其适用于探索克隆空间竞争、微环境互作等前沿问题。

参考文献

1. Augusta Jensen, Helena L. Crowell, Anna Pascual Reguant, Irene Ruano, Sabine Tejpar, Holger Heyn, Mats Nilsson, Sergio Marco Salas bioRxiv 2025.07.02.662761; doi: https://doi.org/10.1101/2025.07.02.662761 IF: NA NA NA

作者在github开源了代码，接下来我们准备使用Xenium5k数据进行测试：

https://github.com/Moldia/InSituCNV