三大单细胞技术【流式、CyTOF、scRNA-seq 】实战对比：如何理解你看到的细胞比例不一样？

在生命科学研究中，流式细胞术（Flow Cytometry, 通常指FACS）、质谱流式细胞术（Mass Cytometry, 商品名CyTOF）以及单细胞转录组测序（scRNA-seq）是三种重要的单细胞水平分析技术。它们各自具有独特的原理和优势，被广泛应用于免疫学、肿瘤学等领域，用于识别和表征复杂细胞群体。流式细胞术诞生于20世纪80年代，利用荧光标记抗体检测单个细胞表面或内部特异蛋白，典型可以同时测量多达十余种标志物，是传统且成熟的单细胞分析工具。经过多年发展，流式技术现已扩展到光谱流式，可通过复杂的光谱拆分检测数十种参数。质谱流式则是近十余年发展的新技术，它将流式细胞术与质谱技术融合：将抗体偶联重金属同位素，用飞行时间质谱读出信号，从而在单细胞水平同时检测~40种蛋白标记物。 

图片

质谱流式克服了传统流式荧光光谱重叠的限制，大幅提高了参数维度，不过由于需经高温等离子体原子化细胞，无法实现细胞的存活分选，且检测通量相对较低。单细胞RNA测序出现于2010年代中期，是通过微流控液滴或微孔平台捕获单个细胞，将其mRNA逆转录并高通量测序，以获取每个细胞的基因表达谱。相比于流式检测预先选定的蛋白标记，scRNA-seq能够无偏倚地同时检测数千基因，发现新的细胞类型和状态。但其成本较高、每次测序细胞数有限（一轮实验通常分析数千至数万细胞），并且需要复杂的生物信息分析将细胞按基因表达分群注释。

经过多年发展，这三种技术各具现状：流式细胞术设备相对廉价快速，仍是生物医学实验室和医院检验的日常工具，用于免疫分型（如淋巴细胞亚群计数）、临床诊断（如血液细胞计数、白血病免疫分型）等；质谱流式因其高参数维度，已在科研中用于深入描绘免疫细胞表型、多重信号通路分析等（例如在黑色素瘤、肾癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤组织中应用质谱流式深入分析肿瘤浸润免疫细胞）。近年来更发展出成像质谱流式（如IMC、CODEX等）可在组织切片上同时检测40个以上标记，实现空间解析。单细胞测序领域更是飞速拓展，自2015年drop-seq测序方法出现后，全球积累了海量单细胞转录组数据，用于绘制人体细胞图谱、发现新的细胞类型和疾病相关细胞状态等。单细胞测序在造血系统发育、肿瘤微环境解析等方面取得诸多突破，同时也催生了单细胞ATAC-seq、空间转录组、单细胞多组学（如CITE-seq同时测定RNA和蛋白）等新技术。总体而言，这三种技术代表了从蛋白到转录本不同层面的单细胞组学手段，各有长短板：流式和质谱流式属于单细胞蛋白组学，直接检测功能相关蛋白且速度快，但需要预先选定标记物；单细胞测序属于单细胞转录组学，参数极高但仅测mRNA，且在细胞捕获和定量上存在一定偏差。本文将从“细胞比例差异”这一角度切入，比较这三种技术在结果上的差异，并结合肿瘤免疫、造血系统、组织发育、肺纤维化四个领域的代表性研究，探讨其应用中的一致性与偏差，以及如何优势互补地联合使用。

Fig. 1

图1：单细胞RNA测序对人外周血单个核细胞（PBMC）的分析示例nature.com。图(a)显示基于scRNA-seq的PBMC细胞聚类UMAP图，每个点为单细胞，不同颜色/数字代表自动聚类得到的不同细胞群。通过参考已知数据集并结合基因表达，可将各簇注释为生物学细胞类型，如表达CD3D和CD4的簇（红色“0”和橙色“1”群）对应CD4^+^ T细胞，表达CD3D和CD8A的簇（粉色“3”和棕色“4”群）为CD8^+^ T细胞，表达CD19的簇（浅蓝“5”群）为B细胞，表达NCAM1(KLRD1)的簇（绿色“6”群）为自然杀伤细胞（NK），表达CD14的簇（深绿“2”群）为单核细胞，等等nature.comnature.com。图(b)展示SingleCellNet分类算法计算的簇与已知参考细胞类型的对应得分热图，不同簇在参考数据集中对应的细胞身份得分不同，亮黄色表示高相关。图(c)显示部分经典marker基因在UMAP上的表达分布，例如T细胞标志基因CD3D主要在T细胞簇中高表达，单核细胞标志基因CD14在簇2.0/2.1中高表达，验证了聚类注释的准确性nature.com。该图体现了scRNA-seq能基于基因表达同时鉴定多种细胞类型和状态的能力。

✅ 三种技术对比表：原理、优势、局限、适用场景

技术比较维度：细胞比例差异的来源与影响

不同技术在检测细胞群体组成时，往往会出现细胞比例差异（cellular proportion distortion），即各方法报告的某类细胞相对丰度不一致。这种偏差可能来自多方面的技术来源和机制，对数据解读和下游生物学结论有重要影响。

1. 样本制备与捕获偏差：

 所有单细胞分析技术都需要将组织处理成单细胞悬液，不同细胞类型在这一过程中存活率和回收率不同，导致比例失真。例如，组织消化酶处理可能使某些细胞更易死亡或无法解离。研究发现，用37℃酶消化会诱导细胞应激和死亡相关基因表达上调，而冷消化能部分缓解这种影响。在一项小鼠肾脏实验中，温酶解处理导致内皮细胞、肾小球系膜细胞等八种细胞类型显著丢失，相比冷处理测得比例偏低。因此，在单细胞测序中，不同组织解离方案会影响最终细胞构成。例如肺纤维化等富含基质的组织中，成纤维细胞等固着细胞可能难以充分解离，scRNA-seq获取的细胞组成往往偏向于易解离的免疫细胞。相比之下，流式/质谱流式通常也需单细胞悬液，经过滤去除团块，同样存在机械损失和存活偏差。但流式常可通过加死细胞染料排除死细胞，从而避免死细胞干扰计数，并可通过染色补偿一定的细胞损失。另外，细胞大小和结构差异也会影响捕获：例如大细胞或易黏附的细胞在微流控芯片中捕获效率较低。单细胞测序的微液滴方法通常要求至少数十万细胞/mL浓度，否则稀有细胞抽样不到。对于样本中基质细胞比例很低的情况，可能需要预先富集（如流式分选富集某亚群）才能在测序中捕获足够数量。这种富集策略虽然增加了目标细胞的捕获量，却人为改变了原始比例（因为非目标细胞被弃掉），需要额外校正才能估计原组织中的真实比例。

2. 技术检测偏差： 各技术对不同细胞类型的检测灵敏度和识别手段不同，也会造成比例差异。流式和质谱流式以预先选定的蛋白marker判定细胞类型，如果某亚群缺乏特异性marker或在所用抗体组合中未被涵盖，可能被归入临近群体，从而低估其真实比例。例如，一项直接比较发现，CyTOF数据中出现了流式未定义的“双阴性T细胞（CD4^-^CD8^-^）”和“双阳性T细胞（CD4^+^CD8a^+^）”簇，而这些亚群在同时进行的scRNA-seq中未能分离出来。这意味着传统流式若未针对性地设置CD4/CD8双阴、双阳分类，就可能将其计入总T细胞或忽略；而scRNA聚类可能因为细胞数量少或转录特征不明显而未识别出该亚群。又如，CyTOF由于使用预定的抗体金属标记面板，如果面板中缺少针对某细胞类型的关键marker，也会导致将该类型细胞并入其他类群。Su等的研究中提到，他们的质谱流式面板未能解析出CD16^+^单核细胞亚群，因此CyTOF未报告该群体，而在scRNA-seq中通过基因表达识别出了CD16^+^单核细胞，结果是scRNA测得的单核细胞总比例比质谱流式更高。反之，单细胞转录组测序依赖于mRNA表达来定义细胞类型，其分辨率受到基因表达水平和数据质量影响。若某两种细胞类型转录组高度相似（例如NK细胞和细胞毒性T细胞都有强烈的细胞杀伤基因程序），可能在聚类时混在一起，导致比例失真。Oetjen等在人骨髓研究中就发现，scRNA-seq难以区分NK细胞与CD8^+^效应T细胞，两者转录谱高度重叠，仅有少数基因差异，在常规滴序数据中未被充分捕获。结果是scRNA-seq把部分NK细胞错分为T细胞或反之，造成NK细胞比例偏低、T细胞比例偏高的现象。相比之下，流式/质谱流式通过同时检测CD3、CD56等蛋白标志，可以清晰地区分NK和T淋巴细胞，因此在骨髓样本中测得的NK和T细胞频率更接近真实。另外，scRNA-seq存在掉线（dropout）效应，即某些基因在实际表达却由于技术原因未测到。如果关键marker基因掉线，细胞可能被误分类。例如少数B细胞由于CD19转录本未被检测到，可能被错误归类为其它细胞，从而低估B细胞比例。质谱流式和流式则不太受此影响，因为蛋白水平更稳定。此外，单细胞测序通常会过滤掉一些数据质量不佳的细胞（如线粒体基因比例过高的死碎细胞）。这些死细胞常常是某些类型（如高吞噬活性的巨噬细胞、某些易裂解的细胞）偏多，如果大量滤除，也可能改变不同细胞类型在分析中的相对比例。

3. 采样深度与统计偏差：

 不同技术一次实验所分析的细胞总数不同，会带来抽样误差。流式细胞术通常可在短时间内检测数十万到上百万细胞，得到的人群频率相对精确且受随机波动影响小。而单次scRNA-seq实验检测的细胞数往往在10^3^-10^5^量级，若某细胞亚群本身比例很低（例如<0.1%），可能根本没有被采到或仅捕获极少几个细胞，从而使其频率估计不稳定。在骨髓样本的研究中，同一样本重复测序两次得到的scRNA-seq结果，在低丰度亚群（如树突状细胞、造血干细胞）比例上波动较大，而流式检测同一样本重复的结果则高度一致。作者推断这是由于scRNA-seq抽样到的细胞有限，稀有群体受泊松抽样误差影响明显。因此，当比较不同样本的细胞组成变化时，scRNA数据需要谨慎统计学处理，区分真实生物学差异与抽样误差。近年来出现了一些专门针对单细胞组成数据的差异分析工具，如scCODA、sccomp等，旨在在高噪声下检测组成显著变化。相比之下，流式/质谱流式通过增加计数可以减小随机误差，但受限于每个样本处理细胞总数，如果目标群极其罕见（如百万分之一），仍可能需要富集策略或结合计算分析检测。

细胞比例差异的影响：

 理解上述偏差来源，对正确解读实验结果至关重要。如果不加注意，可能会对生物学结论产生误导。例如，在跨技术比较中，若看到某技术检测的T细胞百分比比另一技术低，需要考虑是否因为该技术遗漏了某些T细胞亚群或误分类所致，而不能贸然断定是真正的生物学减少。再如，在疾病研究中，如果单细胞测序显示患者组织中的某细胞类型频率显著低于健康人，我们应当核实这是否可能由样本处理或测序偏倚引起——也许患者样本该类细胞更脆弱，在制备过程中损失更多，并非体内真的是减少的。事实上，一些研究已通过正交验证来确保结论可靠：例如Oetjen等在骨髓研究中，发现scRNA-seq的NK细胞频率低于流式，于是增加第三种方法CyTOF验证，发现CyTOF与流式结果一致，证实了scRNA的确低估了NK细胞。由此推断偏差来源于转录组技术局限，而非样本本身NK细胞减少。又如，若想将单细胞测序数据用于**反卷积（deconvolution）**推断组织细胞成分，必须注意单细胞参考中各类细胞比例是否失真，否则卷积结果也会随之偏差。总的来说，不同技术各有偏倚，应尽可能结合多种证据校准。例如，可先用流式粗略量化主要细胞群所占比例，再用单细胞测序刻画精细亚群，相互印证。在下文具体案例中，我们将看到这三种技术在不同生物体系中的表现差异，以及科研工作者如何利用这些差异来增进对生物学的理解。

✅ 细胞比例差异来源对比表

肿瘤免疫领域的比较

在肿瘤免疫研究中，研究者关注肿瘤微环境中的各种免疫细胞类型（如T细胞、NK细胞、髓系抑制细胞等）的比例和状态。流式细胞术和质谱流式因可快速定量已知表型的细胞而常用于免疫监测，而单细胞测序则可发现新的细胞亚群和功能状态。许多前沿研究将这几种技术结合，以全面描绘肿瘤免疫图景。

细胞比例的一致性与偏差： 一般而言，对于主要的大类细胞（如总T细胞、总B细胞等），各技术定量结果大体一致，但在细分亚群上可能出现偏差。例如，在胶质母细胞瘤（GBM）小鼠模型中，Yeo等应用scRNA-seq和流式细胞术纵向跟踪肿瘤进展过程中的免疫细胞变化。利用单细胞转录组，他们全面鉴定了肿瘤发展各阶段的免疫组成，包括早期富集的促炎小胶质细胞、中晚期增多的抗炎巨噬细胞和髓源性抑制细胞等；而通过流式细胞术对不同处理小鼠进行定量验证，发现随肿瘤进展先天免疫成分发生剧变：早期以促炎性小胶质细胞为主，晚期则大量浸润免疫抑制性巨噬细胞和中性粒细胞。这种定量结果得到了患者标本的验证。在该研究中，流式和scRNA-seq对于宏观变化的结论是一致的，表明两种技术在主要细胞比例的趋势上可信度较高。不过，在更精细的亚群上，scRNA-seq能提供流式无法直接观测的信息，例如T细胞耗竭状态和髓系抑制细胞的基因表达特征，而流式定量则更加快速高通量，可用于动态监测治疗（如放疗、化疗）对免疫组成的影响。研究者报告使用流式检测发现：使用替莫唑胺化疗可减少肿瘤中的髓源性抑制细胞，而联合放疗则增加了GranzymeB^+^ CD8^+^ T细胞但也导致调节性CD4^+^ T细胞上升。这些发现是基于数十只小鼠样本流式统计得到的。如果单靠scRNA测序，由于取样量和成本限制，很难获得如此精确的细胞比例变化。所以两者结合实现了广度+深度：流式确保比例量化可靠，scRNA提供功能状态洞察。需要注意的是，scRNA-seq在肿瘤组织中的细胞捕获也存在偏倚，例如实体瘤中肿瘤细胞占据主要比例，免疫细胞相对稀少。为了在测序中得到足够的免疫细胞，很多研究会预先用流式分选CD45^+^白细胞富集后再做scRNA测序。这虽然保证了捕获足量TILs（肿瘤浸润淋巴细胞）等，但无法直接从测序数据计算免疫细胞在肿瘤中的实际比例，必须参考流式或组织病理计数。另一方面，单细胞测序能识别新的或未预料的细胞亚群，然后再利用流式/质谱流式验证其存在并评估比例。例如，早期研究利用scRNA-seq在黑色素瘤中鉴定出耗竭性T细胞亚群，随后通过流式检测程序性死亡受体（PD-1）等蛋白证实此类细胞在进展期肿瘤中富集，并与患者免疫治疗响应相关。总的来说，在肿瘤免疫领域，不同技术报告的主要免疫细胞比例大致一致，但对于功能状态相近的细胞（如NK与CTL、不同亚型T细胞）scRNA可能存在分类混淆，需要借助已知marker（例如CITE-seq同时检测CD3、CD56蛋白）来提升辨别力。

代表性研究案例： 除上述GBM小鼠模型外，还有很多研究比较了多种单细胞技术在肿瘤免疫中的应用。Oetjen等参考文献中提到，质谱流式已被应用于多种人类肿瘤的免疫图谱构建，如黑色素瘤和肾细胞癌等，其结果与经典流式高度吻合。这说明在复杂组织如肿瘤中，只要抗体面板设计合理，流式和CyTOF对于主要免疫群体的定量具有交叉验证作用。另外，一些研究通过空间多重染色结合单细胞数据，在肿瘤组织中验证了scRNA发现的小亚群的定位和丰度。例如某乳腺癌研究中，作者先用scRNA-seq鉴定了肿瘤相关巨噬细胞中具有促血管生成特征的一群细胞，随后设计相应抗体在组织切片上进行成像质谱，证实这些巨噬细胞确实聚集于肿瘤缺氧区域且比例在侵袭性肿瘤中更高。这些综合研究展现了不同技术在肿瘤微环境分析中的互补价值：scRNA-seq发现新现象，流式/质谱定量验证，使人们对肿瘤免疫组成的理解更加全面。

造血系统领域的比较

背景： 造血系统（包括骨髓和外周血）一直是单细胞技术的重要应用领域。一方面，传统免疫学利用流式细胞术定义了清晰的造血分化树（例如用CD34、CD38等标记区分造血干/祖细胞及各系谱前体），另一方面，单细胞转录组揭示了更复杂的连续谱和新亚群。质谱流式则提供了高维度的免疫分型，有助于在人类外周血、骨髓中精细鉴定免疫亚群。由于造血系统获得样本方便、细胞种类繁多，也是比较不同技术细胞比例差异的理想体系。

骨髓单细胞数据的对比： Karolyn Oetjen等人在《JCI Insight》发表的研究是一个典型案例。他们从20位健康供者采集骨髓样本，平行进行了10x单细胞转录组测序和13色流式细胞术，并在部分供者上额外进行了34标记的CyTOF质谱流式。这项研究详细比较了三种技术对于骨髓细胞各主要亚群频率的测定。总体而言，三种方法对骨髓主要细胞类别（如T细胞、B细胞、单核细胞、NK细胞、浆细胞、髓系前体等）的频率估计大致相符，均落在文献报道的人骨髓正常范围内。然而，也发现了值得注意的系统性偏差：单细胞测序法测得的T淋巴细胞频率偏低，而NK细胞频率偏高，与流式细胞术存在显著差异；相反，单细胞测序测得的单核细胞比例比流式略高。具体数据如图2所示。

图片

图2：单细胞转录组测序（红色）与流式细胞术（蓝绿色）测得的人骨髓细胞类型频率比较。图A显示骨髓中各主要细胞群（横轴）在两种技术下的频率分布箱线图，可以看出大多数细胞类型的中位频率在scRNA-seq和流式之间相当一致，但T细胞和NK细胞存在系统性偏差：scRNA-seq的T细胞百分比略低于流式，而NK细胞百分比则高于流式。图B为对应每个样本的散点图，纵轴为流式测得频率取对数，横轴为转录组测得频率取对数。灰色点为其它细胞，彩色点强调T细胞（红）和NK细胞（黄色），可以看到多数样本中红点落在灰色点下方（意味着scRNA测的T细胞比例低于流式），而黄点在灰色点上方（NK比例高于流式）。作者进一步利用CyTOF进行了验证，发现CyTOF与流式测得的T、NK比例高度相关，而scRNA与CyTOF比较则呈现NK和T细胞频率的系统偏移。这表明scRNA-seq可能低估了T细胞、而高估了NK细胞在骨髓中的比例，其原因可能是前述转录组分类混淆（NK与CD8 T转录谱重叠）所致

造成上述偏差的具体机制，研究也有所探讨：流式和CyTOF按照蛋白标记（CD3、CD56等）严格区分了T细胞和NK细胞，而scRNA聚类时，一部分NK细胞因为表达了一些T细胞共同的基因而被错误归类为T细胞，导致T细胞总数减少、NK增加。另外，scRNA-seq在他们的实验中未检测到双阴性T细胞（DN T）和双阳性T细胞（DP T）这两小群特殊T细胞，而CyTOF发现了它们。这些DP/DN T细胞约占总T的几个百分点，scRNA漏检它们进一步拉低了T细胞的测量值。相反，对于单核细胞，scRNA测得比例略高，可能因为在转录组分析中将一些和单核细胞相似的树突状细胞也归入了单核细胞类群，或因为CyTOF未能分出CD16^+^单核亚群使总单核计数偏低。值得庆幸的是，这些偏差幅度相对不大（在几个百分点量级），并不影响对造血系统整体构成的认识。但是在一些应用中，例如精确评估免疫重建患者T细胞数量，或检测罕见异常细胞克隆，单细胞测序的这些系统误差就需要校正或结合流式验证。

外周血细胞组成的比较： 外周血是另一重要对象。Emily Su等人在2024年的研究中，将同一供者的外周血PBMC样本一分为三，分别进行scRNA-seq、CyTOF和传统流式分析，然后比较各技术测得的主要免疫细胞比例差异。他们的结果与骨髓研究有相似之处：总体上流式与CyTOF对各亚群计数非常一致，而scRNA-seq的数据则在某些群体上存在显著偏离。具体而言，scRNA-seq检测到的T细胞百分比比质谱和流式都低，原因同样与遗漏DN/DP T细胞及部分T细胞转录本掉线有关；单核细胞百分比在scRNA中则相对更高，这与单核细胞在转录组中易捕获而质谱中部分流失有关；NK细胞方面，scRNA与CyTOF相当，但流式的数据高于二者，作者推测可能由于流式更敏感地检测到了低表达的NK标记或其它技术因素。这些发现再次提醒我们：即便是对相同样本，不同技术给出的细胞组成也并非绝对一致，研究者在解读单一技术的数据时应参考其他佐证。例如，针对外周血中占比较低的树突状细胞(DC)，单细胞转录组往往捕获数量有限，容易受随机波动影响，而流式可以通过预富集（例如挑选Lin^-^HLA-DR^+^群体）更可靠地计数DC频率。如前所述，Oetjen团队比较了骨髓样本的技术重复性，发现低丰度细胞如pDC（浆细胞样树突细胞）在scRNA双重复中差异较大（一个重复抽到稍多pDC会显著提高频率），而流式双重复则非常一致。因此在依赖scRNA数据估计外周血或骨髓免疫细胞百分比时，最好能结合流式结果进行误差校正。

新亚群的发现和验证： 造血系统长期以来按照流式标记定义细胞群，但单细胞测序揭示了很多传统分类下的异质性。例如，人外周血单核细胞经经典流式可分为CD14^++^CD16^-^（经典单核）、CD14^+^CD16^+^（非经典单核）等，但Villani等利用scRNA-seq发现了一个新的单核细胞亚群（表达特定基因模版，与树突细胞和单核细胞均不同），即后被命名为中间单核细胞。这种新细胞类型最初难以通过常规流式区分，但在知道其特异基因后，随即开发出了对应的抗体（如SLAN等）用于流式分选，从而测定其在健康和疾病中的比例。又如，在胸腺T细胞发育研究中，单细胞RNA测序描绘了连续的分化轨迹，显示传统流式划分的DN、DP阶段内部还存在多个过渡状态。为了深入研究这些过渡亚群，科研人员使用流式细胞术根据新的marker组合富集这些细胞，再行单细胞组学分析。这说明流式和测序是相辅相成的：scRNA-seq提供全局视野和发现能力，而流式可根据scRNA线索精确地定义并量化新亚群在大样本队列中的比例。总体而言，在造血系统这样相对容易取材、细胞定义明确的体系中，各技术定量的细胞组成大体吻合，但科学价值更多体现在利用三种技术互相验证、完善分类体系方面。一方面，多技术交叉确保了细胞比例数据的可信度，另一方面，也促进我们更新对造血细胞谱系的认知，从“一棵分叉树”细化为“连续分化景观”。

组织发育领域的比较

背景： “组织发育”在此泛指胚胎/器官发育过程或组织再生过程中的细胞组合变化。这类研究往往涉及细胞状态随时间推移的动态变化，以及多种细胞类型的相互作用。在传统发育生物学中，研究者常用流式细胞术通过标记选取特定分化阶段的细胞进行分析，例如根据细胞表面标志物纯化造血干细胞及各分化子集，然后检测其功能基因表达或分化潜能。而单细胞测序兴起后，可以在没有预先标记的情况下捕获发育过程中所有细胞类型，重建分化轨迹和时空关系。这为组织发育研究带来了新视角，但也产生了细胞比例如何对应真实组织的问题，因为发育过程中的细胞类型分布随时间剧烈变化，且某些阶段细胞极其稀少或难以分离。

技术优势与偏差： 在发育研究中，流式细胞术能够以已知标记为依据从复杂组织中分选出目标细胞。例如，在胎鼠造血研究中，用流式分别分选出Lin^-^Sca-1^+^c-Kit^+^（LSK）造血干细胞、CLP淋巴前体、CMP髓系前体等，分别进行转录组测序，可以获得清晰的各类细胞基因表达谱。然而，这种方法假定了我们对细胞类型边界的了解，且富集分选会丢失整体比例信息。相反，一些研究选择对发育样本不加富集直接做单细胞测序，从而绘制出全细胞图谱。例如Tabula Muris项目对小鼠多个发育阶段组织进行了这种全范围的scRNA-seq描绘，发现了一些之前未定义的过渡性细胞状态。但要注意，此时测序数据中的细胞比例未必等同于体内真实比例：因为捕获效率和细胞大小、存活等因素会造成偏差。例如，在胚胎发育早期，细胞很小且核糖体RNA多，10x测序可能对这些细胞捕获率较低；又比如在组织形成过程中，一些细胞（如即将凋亡的多余细胞）可能更易在制备中死亡而未被测序捕获。相比之下，流式可以通过形态和凋亡染色（Annexin V等）实时辨别细胞活力并计数，对于统计细胞命运分布很有帮助。

一个具体例子是胸腺T细胞发育：胸腺中的T细胞前体按经典模型分为双阴性（DN）、双阳性（DP）、单阳性（SP）阶段，各阶段比例在胸腔有所差异（DN和SP约各占10%，DP占80%）。如果直接对未富集的胸腺细胞做scRNA-seq，得到的绝大多数细胞会是DP阶段，DN和SP细胞由于比例小，捕获到的可能很少，影响后续分析的可靠性。为此，研究者通常先用流式按照CD4/CD8等标记将DN和SP细胞分别分选富集，再分别测序分析各自内部的异质性。这种方法成功揭示了DN阶段内部复杂的四个亚群（DN1–DN4）转录特征，以及SP阶段细胞进一步分化为外周效应T细胞的轨迹。但因为预先富集，单细胞数据本身无法告诉我们DN或SP占胸腺总细胞的比例——需要参考流式分析的结果（DN+SP约占20%，DP约80%）。这个案例说明，在发育研究中比例信息和细节信息往往不可兼得，需要多技术结合：流式提供整体构成框架，单细胞测序提供每类细胞的细节。另一个例子是在再生医学中，有研究通过scRNA-seq发现了肝脏再生过程中一种过渡性肝细胞状态（同时具有干细胞和成熟肝细胞特征）。他们随后开发了针对该状态细胞表面特异标记的抗体，用流式在更多模型中定量追踪这些细胞出现的时序和比例变化，证实了这一过渡亚群在再生早期短暂占比上升然后消失。这种验证过程体现了不同技术协同增效：scRNA发现“新细胞”，流式告知“有多少细胞、出现多久”。

对比例差异的理解： 由于发育过程本身细胞比例动态变化大，在这一领域谈“比例差异”更多是指技术对真实变化的反映是否失真。例如，发育过程中某细胞类型从10%增至30%，理想情况下三种技术都应观测到类似的增幅。但如果单细胞测序对该细胞捕获效率偏低，可能只从2%增到5%，低估了变化幅度。幸而，很多发育研究更关注出现/消失的定性变化和基因程序，不严格依赖测序中的绝对比例。但随着单细胞定量分析方法进步，我们也希望提高scRNA在定量变化上的准确性。这需要改进实验流程（如优化解离减少死亡选择性、提高文库复杂度减少掉线）以及发展计算模型校准偏倚。一些最新算法尝试利用流式已知的总体比例对单细胞数据进行约束，使之输出的成分比例更符合真实。例如，有方法以流式数据作为先验，对scRNA-seq聚类得到的细胞类型数量按贝叶斯方法进行调整。总的来说，在组织发育研究中，各技术的细胞比例读数需要结合时间维度和技术特性综合考虑，互为校验。例如，对于一个推测的重要过渡细胞，我们既要看转录组数据证明它存在并具生物学意义，也要通过流式/质谱确认它在关键时间点的相对丰度，确保不会被夸大或忽视。

肺纤维化领域的比较

背景： 肺纤维化（如特发性肺纤维化IPF）是一种进行性肺疾病，其病理特征是在肺组织中异常累积纤维组织，伴随慢性炎症。研究发现，免疫细胞和基质细胞在纤维化进程中扮演重要角色。近年来单细胞技术被用于解剖IPF患者肺组织和外周血中的细胞组成改变。例如，通过scRNA-seq鉴定出了IPF中异常增殖的肺成纤维母细胞亚群和衰老上皮细胞状态。这一领域也是整合流式、CyTOF和scRNA技术以获取完整图景的典型场景。

细胞组成评估： 在IPF肺组织中，经典流式常用于区分上皮细胞、间质细胞和免疫细胞的大致比例，而CyTOF等高维流式则进一步细分免疫细胞亚群。单细胞测序则能同时覆盖免疫和非免疫细胞，绘制整个细胞生态。例如，Serezani等在2022年的研究中，对12例IPF患者和15例对照供体肺组织中的免疫细胞进行了质谱流式分析，并结合公开的单细胞转录组数据进行比较。质谱流式结果显示，与正常对照相比，IPF患者肺内肺泡巨噬细胞（AMφ）和树突状细胞（DC）显著增加，而单核样巨噬细胞和间质巨噬细胞减少；此外在淋巴细胞中发现三类记忆T细胞（CD4^+^驻留性TRM、CD8^+^驻留性TRM和CD8^+^效应记忆T细胞）在IPF中富集。这些定量发现为IPF的免疫异常提供了线索。接着研究者利用单细胞RNA测序数据深入刻画了这些在IPF富集的细胞的功能状态，发现IPF患者肺泡巨噬细胞和DC中IFN-γ响应通路显著上调，并伴有抗原处理和吞噬功能增强，而增多的记忆性T细胞中也富集了干扰素响应和激活信号。这一系列结果的取得，正是依赖于质谱流式的准确定量和单细胞测序的深度解析相结合：前者告诉我们IPF病变肺里哪些细胞明显增减，后者揭示这些细胞分子特征的改变。两者结合，让我们更全面地理解了IPF的免疫发病机制。例如，单有scRNA数据，我们或许能注意到AMφ存在亚群差异，但无法断定其总体数量变化是否重要；单有流式数据，我们知道AMφ变多了，但不清楚这些AMφ是否处于特殊活化状态。综合分析则表明：IPF肺中AMφ和DC不仅数量增多，还表现出强IFN-γ刺激痕迹，提示可能受到持续的Th1型炎症刺激。

偏差与一致性： 在肺纤维化研究中，各技术对细胞比例变化的结论大体一致。例如，多项研究发现IPF患者外周血中经典单核细胞比例升高而非经典单核细胞下降，这在流式计数和单细胞转录组分析中均得到验证。但是，对于肺组织内部一些细胞，由于取样和处理困难，不同技术报告可能有差异。比如成纤维细胞是纤维化的核心细胞，但它们高度依赖细胞外基质支架，单细胞悬液制备可能损失一部分活性成纤维细胞。单细胞测序数据显示IPF肺里成纤维细胞簇显著扩大，但具体比例仍需依赖组织切片计数或体外培养推断。流式细胞术可以使用如纤连蛋白受体等表面标志初步鉴定成纤维细胞，但由于这些标志特异性不如免疫标志，流式对纤维细胞计数的准确性有限。因此，在这个领域，细胞比例更多地通过综合手段获取：免疫组化/成像质谱给出空间上的相对丰度，流式给予定量框架，单细胞测序提供类型拆解。例如，针对IPF中新发现的一种病理性成纤维细胞亚群（具有高WNT信号活性的肌成纤维细胞），研究者在scRNA中锁定了它的特征基因，再用原位杂交和流式证实其主要存在于纤维灶区域且占总成纤维细胞的~15%。这个过程表明，不同技术的结合可以修正彼此的偏差：scRNA发现了亚群但无法准确衡量其在组织中的占比，通过流式/成像来补足定量。同时，流式可能因为抗体特异性不足混入其他细胞导致计数偏高，通过scRNA基因签名可以确认流式门控群体的纯度。例如，一些流式定义的“肌成纤维细胞”门可能包含平滑肌细胞，必须借助转录组数据分开计算。理想情况下，多种技术的交叉应用使我们能够既知道“谁在变多/变少”，又知道“这些细胞有何异常功能状态”，从而全面理解疾病机制。

✅ 四大应用领域中的技术表现对比

技术整合建议：优势互补的细胞组学策略

综合上述比较可以看出，流式细胞术、质谱流式和单细胞测序各有优劣，因而在研究设计中联合使用往往能取得更佳效果。以下是几条技术整合的建议：

• 1. 利用流式/质谱流式进行定量基准，scRNA-seq进行深度解析： 正如很多研究范例所示，可先用流式或CyTOF获取大量样本的细胞组成“全貌”，确定主要细胞群的比例和变化，再选择具有代表性的样本进行单细胞转录组测序，深入发掘这些细胞群内部的亚结构和基因调控。这种“宏观->微观”的组合能避免仅凭scRNA少量细胞就贸然推断比例变化，也能防止只做流式而错过重要的新亚群。特别在涉及疾病队列时，可以先大规模流式筛查找出对疾病表型有显著关联的细胞比例改变，再对这些样本进行scRNA分析以寻找致病机制。这种策略在肿瘤免疫、自身免疫病研究中已被证明可行。

2. 善用多模态单细胞技术（如CITE-seq、TEA-seq）： 新兴的方法如CITE-seq（细胞索引转录组与表位测序）将流式的蛋白定量与RNA测序结合在同一细胞，实现“一细胞双读出”。具体做法是在单细胞悬液中加入带DNA条形码的抗体，与细胞一起封装测序，既获得转录组又获得选定的蛋白表达量。通过这种方式，可以在scRNA数据中准确嵌入关键流式标记信息。例如在前述NK与T细胞难分的问题上，如果做CITE-seq并加入CD3、CD56抗体标签，就能明确区分哪些细胞是T或NK，从而校正转录组聚类的错误。此外还有ATAC+RNA共测、测序读出流式FACS索引排序信息等多模态技术，都可以帮助整合各自优势，减少单一技术偏差带来的不确定性。

3. 建立跨技术的标尺和校准： 如果无法在同一细胞上做多模态，那么在群体水平也可建立校准曲线。例如，可对同一样本分别做流式计数和scRNA-seq，根据流式已知某类细胞真实频率，对应校正scRNA中该类细胞的检出频率。Su等的研究就提供了一套宝贵的参考数据集，涵盖PBMC不同技术的细胞比例，可用于校正别的单细胞数据集中类似细胞的推断频率。计算方法上，可以采用如Bayes校准、分层标准化等使两者对齐。当然，这需要有足够配对的多技术数据支持，未来应鼓励更多类似研究作为细胞组学的“标准品”。

4. 联合分析和可视化： 在下游数据分析阶段，可以将流式/CyTOF与scRNA的数据进行集成。例如，一些软件工具允许将流式数据投影到单细胞转录组的UMAP空间，或反之用scRNA聚类指导流式分群。还有研究利用机器学习模型，让转录组数据预测流式的marker表达，从而在scRNA聚类中模拟“流式 gating”，获得更易解释的细胞群定义。比如COMET算法利用scRNA数据筛选最能区分各群体的蛋白marker面板，然后可在流式中验证这些marker组合对群体分类的有效性。这些分析上的结合可以帮助研究者更直观地理解不同数据的对应关系。例如，通过在同一t-SNE图上标注流式群体和scRNA群体，可检查哪些群落是一致的，哪些存在拆分或合并，从而发现技术偏差来源并加以修正。

5. 样本处理和实验设计优化： 从源头上减少比例失真的方法包括：优化组织解离方案（如尽量短时间温和消化，降低不同细胞型的不均一损失）、充足的生物重复和统计支持来识别技术噪声、在可能情况下增大单细胞测序的采样深度以涵盖更多稀有细胞等等。在实验设计阶段，如果预计某关键细胞群比例极低，可以考虑先用流式富集（但要意识到这会丢失全局比例信息，需要另设对照测全貌）。或者采用**核单细胞测序（snRNA-seq）**替代细胞测序，对于那些在细胞消化中易破碎的细胞类型，核测序可能提供更均一的代表性。同时，应用固定保存手段（如Methanol固定）也可能减少处理过程中细胞选择性损失，从而更真实地保留原始比例。总之，根据具体研究目的和细胞特性，提前规划好三种技术的取样量和组合，可以最大程度发挥各自优势、规避偏差陷阱。

结语

单细胞组学技术正在不断迭代，流式细胞术、质谱流式和单细胞测序三者并非孤立竞争关系，而是逐渐走向融合协作。在未来，我们预计会看到：（1）技术融合度提高： 更多多模态单细胞测序方法出现，如同时测RNA、蛋白、表观修饰甚至分泌因子的“一管法”测序，将极大减少跨技术偏差，让我们对细胞状态的认知更全面。（2）数据整合和标准化：** 随着公共数据库中累积了不同平台的数据，发展跨平台的数据整合作工具将成为趋势，比如将流式的大样本统计优势与scRNA的高维特征优势结合建模，提升对细胞组成的推断准确性。（3）应用于临床转化：** 流式细胞术已是许多临床诊断的金标准，而单细胞测序虽在研究中如火如荼，但在临床尚未广泛应用。未来如果能克服成本和时间瓶颈，将单细胞测序与流式检测结合用于患者样本分析（例如癌症免疫疗法中同时监测外周血免疫细胞比例和转录状态），将有望提供更精细的诊断和监测指标。（4）空间维度加入： 单细胞测序缺乏空间信息，而流式完全不保留空间。新兴的空间组学技术（如空间转录组、成像质谱流式）可弥补这一缺环。展望未来，一个理想的细胞图谱研究可能会综合空间定位、蛋白定量和转录组描绘，全面再现组织中各细胞的数量、类型和相互作用。

总而言之，透过“细胞比例差异”这扇窗口，我们更深刻地认识到每种技术观察到的细胞世界都有其滤镜。唯有善用多种工具、彼此印证，才能逼近真相。在科研实践中，应根据科学问题选择合适的技术组合，并对数据中的细胞比例差异保持审慎态度。这样才能在纷繁复杂的单细胞数据中抽丝剥茧，获得可靠的生物学见解。未来，随着技术不断融合与创新，我们有理由期待更精准、全面的单细胞组学时代的到来，为生命科学和医学研究带来革命性突破。

生信小博士

【生物信息学】R语言开始，学习生信。Seurat，单细胞测序，空间转录组。 Python，scanpy，cell2location。资料分享

281篇原创内容

公众号

参考：
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4860251/#S6

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6328018/#:~:text=CD8%2B%20cytotoxic%20T%20cells%20and,bias%20are%20likely%2C%20however%2C%20multifactorial
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10118026/#:~:text=intensive%2C%20droplet%20systems%20like%20the,47
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10118026/#:~:text=Traditionally%2C%20flow%20cytometry%20has%20been,Particularly%20for%20investigating%20the%20immune
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38707902/
https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-020-02048-6#:~:text=,two%20tissue%20dissociation%20protocols

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6610714/#:~:text=Determining%20cell,Moreover%2C%20we%20observed
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35468042/#:~:text=and%20used%20existing%20single,RM%7D%29%20and%20CD8%2B%20effector