杂交瘤技术自 Köhler 与 Milstein 于 1975 年首次提出以来,已成为获取单克隆抗体的经典平台技术之一。 该方法通过融合免疫活化的 B 细胞与骨髓瘤细胞,获得能够稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,是目前最为成熟的抗体开发策略之一。 本文从技术流程角度出发,系统介绍杂交瘤构建、克隆筛选及抗体表达纯化的关键环节。一、杂交瘤构建:融合细胞的形成与筛选杂交瘤构建的起始环节为抗原免疫,常选用 BALB/c 小鼠作为实验模型。 三、杂交瘤细胞扩增与抗体表达系统筛选出的稳定杂交瘤细胞可用于体外小规模或中等规模抗体表达,适用于科研级抗体制备。 杂交瘤服务作为抗体开发的核心支撑技术,其流程虽已标准化,但在特异性抗体的获得、稳定细胞株构建、表达体系选择及纯化策略上仍存在大量技术细节可优化。
DRUGONE 1975年,Köhler 和 Milstein 发明了杂交瘤技术,用于制备具有特定抗原结合能力的鼠源单克隆抗体。 1975年,研究人员首次提出了杂交瘤技术:通过将免疫小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞融合,获得了能够无限增殖并持续分泌特定抗体的“杂交瘤细胞”。 杂交瘤的诞生被认为是生命科学的重大里程碑,并迅速获得了诺贝尔奖的认可。其潜力在于,它不仅推动了研究工具的标准化和普及,更奠定了单克隆抗体作为治疗药物的未来基础。 从1975年杂交瘤诞生,到1986年首个单抗药物Muromonab-CD3获批,经历了长达11年的等待。 从杂交瘤到人源化,从单一IgG到ADC与双特异性,从静脉输注到皮下注射,每一次技术革新都显著提升了临床价值。 未来,随着人工智能、工程化设计与递送创新的加入,抗体治疗将继续突破边界,攻克更多复杂疾病。
与传统的杂交瘤技术不同,单B细胞筛选技术避免了杂交瘤细胞培养的繁琐过程,且能够在短时间内获取更为多样的抗体库。 单克隆抗体的发现技术目前,单克隆抗体的发现技术主要包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术和单B细胞筛选技术。特别是单B细胞筛选技术,因其研发周期短、效率高而受到越来越多的关注。 1、杂交瘤技术杂交瘤技术是最早应用的单克隆抗体生产技术,它通过将免疫动物的B细胞与肿瘤细胞融合,生成既能无限增殖又能产生抗体的细胞系。 因此,杂交瘤技术的应用逐渐受到一些限制。2、噬菌体展示技术噬菌体展示技术是将抗体的DNA序列插入到噬菌体的外壳蛋白基因中,使抗体在噬菌体表面展示。 避免杂交瘤过程传统的单克隆抗体筛选依赖于杂交瘤技术,即通过将免疫B细胞与肿瘤细胞融合来获得能够无限增殖的B细胞系。这一过程费时费力,并且容易导致筛选出的抗体在亲和力和特异性方面的欠缺。
杂交瘤技术的突破:Georges Köhler 和 César Milstein 发明了细胞融合技术: 融合: 将小鼠脾脏细胞(提供特异性抗体产生能力)与骨髓瘤细胞(提供无限增殖能力)融合。 筛选: 利用特定药物筛选出杂交瘤细胞(亲本骨髓瘤细胞被杀死,脾细胞自然死亡)。 克隆: 通过单细胞培养,筛选出能分泌特定抗体的杂交瘤克隆。 人源单克隆抗体的现代制备 虽然杂交瘤技术主要应用于小鼠,但目前治疗性的人源单克隆抗体主要通过以下基因工程技术制备: 噬菌体展示技术 重组 DNA 技术(克隆人浆细胞抗体基因) 携带人类抗体基因的转基因小鼠 当这些重组抗体基因被导入合适的宿主细胞系,例如导入非抗体产生的杂交瘤骨髓瘤细胞时,被导入的细胞就可以分泌针对特定抗原的单克隆抗体。
杂交瘤抗体开发与单B细胞抗体筛选传统的杂交瘤抗体开发技术通过细胞融合和限稀克隆,稳定获得高特异性抗体。现代技术如单B细胞抗体筛选则利用流式细胞分选技术,快速锁定靶向抗体序列,提升筛选效率与多样性。 图1 小鼠杂交瘤抗体开发图2 兔单B细胞抗体筛选快速抗体制备与高效筛选针对科研的紧迫需求,快速抗体制备技术能够显著缩短抗体研发周期,快速获得初筛抗体。 Q3:杂交瘤技术制备单克隆抗体的关键步骤包括哪些?A:主要步骤涵盖抗原免疫、脾细胞与骨髓瘤细胞融合、融合细胞筛选与限稀克隆、抗体表达与功能鉴定等环节。
杂交瘤技术:适用于小鼠等模式动物的免疫抗体开发,具备成熟的筛选与亚克隆平台。单B细胞筛选技术:通过流式细胞分选和单细胞测序技术,可直接获得天然重链-轻链配对的人源或动物源抗体。 常见问题 FAQQ1:重组抗体与传统杂交瘤抗体有何区别?A:重组抗体通过体外表达系统获得,纯度更高、批间一致性更好,适合工业化生产;杂交瘤抗体则来源于细胞株分泌,可能存在轻重链错配及污染风险。
杂交瘤技术在兔体内效率低且细胞株不稳定,难以规模化应用;噬菌体展示和其他体外筛选方法虽灵活,但常出现重轻链错配,影响抗体功能。 与杂交瘤相比,该方法避免了细胞融合效率低下及不稳定性问题;与噬菌体展示相比,它能够保持重链和轻链的天然配对,更真实地反映免疫系统的应答。因此,单B细胞筛选技术在速度、效率和准确性上均具有优势。 该技术不仅克服了传统杂交瘤与展示库方法的不足,还能在保持天然 VH/VL 配对的同时,大幅提升抗体筛选效率。
单克隆抗体(mAb):通过杂交瘤技术或单B细胞克隆,从单一B细胞获取抗体,具有高度一致性与特异性。重组抗体(rAb):通过抗体基因克隆表达,获得来源清晰、易于工程化的抗体,适合工业级需求。 二、抗体定制服务类型简述类型特点适用领域多克隆抗体快速、成本低、识别多个表位信号增强实验、早期探索性实验杂交瘤单抗高特异性、一致性好、稳定表达机制研究、诊断抗体开发重组抗体基因工程表达、来源明确、易于修饰药物筛选
传统的杂交瘤技术虽然成熟,但周期长、效率低,而且抗体多样性有限。近年来,单B细胞技术的出现,正在彻底改变兔单抗的研发模式。 相比传统杂交瘤技术,单B细胞技术具有显著优势:每个B细胞只产生一种抗体,避免混杂;可以筛选出亲和力最强的抗体;结合流式细胞和微流控技术,实现高通量分析;快速响应新兴病原体和疫苗研发需求。
Q7: 噬菌体展示与杂交瘤技术筛选抗体各有什么优劣?A:趋势:目前大型药企更倾向结合两者优势,如先通过噬菌体展示初筛,再用杂交瘤技术生产全长抗体。Q8: 如何选择适合的高通量抗体筛选平台?
单克隆抗体筛选单克隆抗体由单个B细胞克隆产生,技术上常采用杂交瘤技术。通过将B细胞与骨髓瘤细胞融合,形成能够持续分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。随后通过ELISA或流式细胞术筛选高亲和力克隆。
通过这些技术,可以直接获得高质量的单克隆抗体,省去了传统杂交瘤细胞的制备过程。 基因工程小鼠:基因工程小鼠的免疫系统能够直接生成与人类免疫系统相似的抗体,避免了传统杂交瘤技术中使用的动物免疫原和骨髓瘤细胞融合步骤。
与传统的噬菌体展示技术或杂交瘤技术相比,单细胞抗体筛选避免了抗体库构建中重链与轻链配对错误的问题,天然保留抗体的基因配对信息,显著提升筛选出的抗体的功能和特异性。 相比传统的噬菌体展示和杂交瘤技术,它避免了抗体重链和轻链配对错误,筛选效率更高,能够更快发现高亲和力抗体,适合抗体药物开发和科研实验。Q2: 单B细胞克隆技术如何保证抗体基因的完整性和准确性?
主要流程 使用表达不能结合HER2抗原的变异体(CDRH3基因突变序列)的杂交瘤细胞系,由CRISPR-Cas9介导的同源定向突变(HDM)生成文库,并通过DMS检测筛选抗体的CDRH3的氨基酸序列和指导抗体文库的生成
随后通过杂交瘤技术,生产出能识别这些细胞表面抗原的单克隆抗体。 2.
重组抗体一致性:相较于传统杂交瘤抗体,重组单克隆抗体具有批次间一致性,有利于科研数据标准化。
人工智能加速抗体发现 传统上,mAbs最初是通过实验技术(如杂交瘤筛选)或高通量平台(如酵母或噬菌体展示)来发现的(即hit识别或HI)。
当然,血清还是实验 Buff:病毒培养、杂交瘤存活、冻存保护……血清在手,科研不愁!细胞的“米其林厨房”如何炼成?血清生产流程:血液采集 → 凝固分离 → 三级过滤 → 质检分装 → 冷链配送。
产生的杂交瘤细胞继承了双亲细胞的能力,一旦制备成功就可以不断产生完全一致的单克隆抗体了。
抗体药物的优化耗时间耗资源、极具挑战 在抗体药物发现中,从靶点到苗头化合物阶段是一个成熟的过程,杂交瘤筛选、噬菌体展示筛选、酵母展示库通常都会产生一些潜在的先导候选药物。