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- 来自专栏分子生物和分子模拟计算
荧光探针分子与蛋白质的作用
通过分子对接和分子动力学模拟，验证探针分子与蛋白的作用形式和结合位置，解释荧光发光的机理。
45730发布于 2018-07-03 - 来自专栏DrugOne
Nature | 全新设计的跨膜荧光激活蛋白
这些 tmFAPs 能够特异性激活目标荧光配体 (HBC599)，显示出 中纳摩尔亲和力，并且 亮度和量子产率 显著高于 增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)。 研究目标 通过结合深度学习 (AlphaFold 2, ColabDesign) 和能量优化 (Rosetta)，设计具有 高活性和高特异性 的 荧光激活跨膜蛋白 (tmFAP)； 验证设计蛋白在 细菌和真核细胞膜中 的 荧光激活功能和结构稳定性； 证明 人工化学物质 (HBC599) 与跨膜蛋白在膜环境中 的 非共价相互作用 可以被 精准设计。 研究方法 本研究采用 两步设计协议： 水溶性荧光激活蛋白 (wFAP) 的设计 利用 四螺旋束 (four-helix bundle) 背骨，构建 中心口袋，以 氰基苯乙腈 (HBC599) 作为目标荧光配体 实验验证与结构解析 荧光激活实验 体外荧光激活实验：在 E. coli 和 CHO 细胞 中表达后显示出 强烈的荧光激活； 配体结合亲和力 (Kd) 测定：通过 荧光滴定实验 计算 HBC599 的 Kd
28010编辑于 2025-02-20 - 来自专栏聊点学术
如何降低荧光实验的自发荧光？
紫外和紫光区域激发的有色氨酸类、吲哚胺类、纤维蛋白原、二聚体、胶原等，蓝光区域激发主要是NADH、脂褐素、吲哚胺类、二聚体、核黄素等等。 3 — 自发荧光消除原则 3.1 标本固定 标本常规采用中性的多聚甲醛固定，而醛类固定剂会与胺和蛋白反应生成荧光产物，是造成自发荧光的重要因素之一。戊二醛的影响则是更大的。 若血清质量不好，里面可能含有纤维蛋白原(正常血清是不含有纤维蛋白原的)，一旦沾到组织上，基本洗不掉了，也会增强自发荧光信号。此外，低质量的血清还包含有很多其它杂质。 因为低质量的荧光二抗中往往残留较多的未标记游离荧光素，游离的荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，它们的自发荧光也是很强的。有人曾建议采用层析或者透析的方式去除，但是其实操性往往不甚理想。 3.2.5 阴性对照 必须要确定切片脱蜡之后，在不加二抗的情况下是否还能继续发荧光。这是我们判断是否存在自发荧光的金标准。 4 — 切片的漂洗 为什么单独地将这一步拎出来呢？
2.7K60发布于 2020-07-22 - 来自专栏生命科学
细胞转染、重组蛋白、荧光素酶检测试剂盒实验 | MedChemExpress
本心法中的 是由高质量的鼠源 lgG2b 单克隆抗体与琼脂糖 Sepharose 4B 共价偶联而得，具有较高的 Flag 标签蛋白结合容量，可用于细菌和哺乳动物细胞裂解物以及体外表达系统中 Flag “六合心法”第三式 ■ 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 (Renilla-Firefly Luciferase Dual Assay Kit) 荧光素酶是自然界中能够产生生物荧光的酶的总称，可催化荧光素氧化成氧化荧光素 ，并在此过程中发出生物荧光，可用荧光测定仪测定。 目前最常见的荧光素酶是萤火虫荧光素酶 (Firefly luciferase) 和海肾荧光素酶 (Renilla luciferase)，前者用于荧光素酶报告基因的检测，后者则作为内参，消除细胞生长状态 对多种常见细胞具有高水平转染效率，对原代细胞和难转染细胞也具有较好的效果 Anti-Flag Affinity Gel 是一种纯化的小鼠 IgG2b 单克隆抗体，共价连接琼脂糖 Sepharose 4B
47610编辑于 2023-03-03 - 来自专栏聊点学术
【原理篇】免疫荧光染色的平均荧光强度
一般来讲，荧光标记染色的目的有3个：①多种蛋白标记后，分析蛋白在空间上的分布特征；②免疫荧光标记后进行蛋白半定量分析，分析蛋白半定量表达量；③标记细胞核，以便分析细胞核数量，如凋亡细胞计数等。 ? 上方所述的第1条和第3条是荧光标记染色的最佳应用场景，个人并不推荐将荧光标记应用于第2条。原因在以前就讲过→【回顾：免疫荧光分析误区，别踩雷了！】 如果一定要在荧光图像上进行蛋白半定量分析呢？ ---- 1、灰度的概念应用 与WB蛋白条带分析原理一致，免疫荧光分析也是围绕灰度进行分析。不同的荧光强度本质上可以理解成灰度值的差异，因为在分析时，我们是在同一通道下进行比较的。 积分灰度值即图像上目标区域所有像素点的灰度值之和，可以代表目标区域所包含蛋白的总相对表达量。 平均灰度值即目标区域积分灰度值除以目标区域面积，可以代表目标区域的平均蛋白表达量。 常做蛋白条带分析的人肯定清楚，分析之前，先对原始图像去色，然后再转换成8bit 黑白图。荧光图像的灰度分析，也是这么个道理。 4、测量 测量是很简单的。
5K20发布于 2020-11-25 - 来自专栏聊点学术
【分析篇】荧光共定位的散点图解析！
聊点学术 上期推文中，我强调了荧光共定位定量分析的三大要点。→【操作篇】荧光共定位的定量分析！ 说明：蛋白A和蛋白B存在一定的共定位关系，但蛋白A荧光强度高于蛋白B。 ? ● 形态2： 总体呈直棒形状，线性分布，对角分布。 说明：蛋白A和蛋白B存在很强的共定位关系，且蛋白A荧光强度与蛋白B基本相当。 ? ● 形态3： 总体呈棒槌状，基本线性分布，靠近X轴（红色通道）。 说明：蛋白A和蛋白B存在一定的共定位关系，但蛋白B荧光强度高于蛋白A。 （2.2）如果蛋白A（红色通道）和蛋白B（绿色通道）的共定位关系很弱，那么散点图中的散点分布会呈现以下内凹形态，这。 ? （2.3）散点图中4代表的是共定位荧光图像中的背景荧光，该区域内散点越多，说明背景荧光越强，散点图中会呈现以下形态。 ? 下期预告：单通道荧光的散点图获取 往期推荐阅读： 各种细胞器典型标记物。
3.7K30发布于 2020-09-04 - 来自专栏聊点学术
免疫荧光分析误区，别踩雷了！
问题3：蛋白免疫荧光适合半定量分析吗？ 答：不适合。免疫荧光染色的关键是荧光二抗，之后在荧光场下进行拍照，留取照片。 同样一张切片、细胞爬片，采用国产荧光二抗和进口荧光二抗，效果上存在非常大的差异，用过的都知道。此时，我们难道就能仅仅凭借荧光强度和分布范围就说蛋白表达水平不同吗？显然不行。 变量②：荧光拍摄条件。 变量这么多，你还敢对免疫荧光染色进行半定量分析吗？ ? 问题4：为什么WB蛋白条带可以半定量分析，而蛋白免疫荧光却不行呢？ 尽管也存在信号衰减的问题，但是此时所有孔代表蛋白的荧光衰减程度是一致的。 荧光染色就不一样了，它的图像采集时间更长，且你不可能同时对拍摄所有的切片。 、胞核）进行评价，通过采用半定量分析法分析蛋白表达水平，巩固Western Blot半定量分析的结果； ④采用免疫荧光的方法，对目标蛋白的空间分布进行再评估，以巩固免疫化学染色时对蛋白空间分布的评估，
3.5K20发布于 2020-07-21 - 来自专栏聊点学术
【操作篇】荧光共定位的定量分析！
聊点学术 荧光共定位是很常见的实验方法，一般用来验证2种或3种蛋白是否存在共定位关系。在常规Protocol的指导下进行实验操作，很容易得到双荧光或多重荧光染色图像。 ? 这种图像，一般由红色通道（代表蛋白A）和绿色通道（代表蛋白B）两种图像merge后得到。 ? （红色通道：蛋白A） ? （绿色通道：蛋白B） 仅仅通过肉眼和语言描述是很难说清楚蛋白A和蛋白B的共定位程度到底如何。因此，我们需要对这种共定位关系进行定量分析。 4.点完后，我们会得到一张图像。 （这是红色通道-绿色通道性形成的散点图，可以看出散点几乎都落在对角线上，说明红绿通道相关性极强，且红绿通道荧光强度基本相当。） ? 5. 什么是荧光原位杂交(FISH)？ 如何降低荧光实验的自发荧光？ Co-IP免疫共沉淀 【长文】—染色质免疫共沉淀（ChIP）原理及注意事项 Ending
5.2K30发布于 2020-09-04 一种高效、稳定的氨基反应性荧光标记染料
该官能团可在温和的生理pH条件（pH7.0-9.0）下，特异性地与目标生物分子（如蛋白质、多肽、抗体或氨基修饰的寡核苷酸）表面的伯氨基发生高效的亲核取代反应，形成稳定的酰胺键，从而实现荧光标记物的共价、 4.出色的光稳定性与pH稳定性：相较于某些传统染料，pHAb染料对光漂白有更强的抵抗能力，能保证在长时间成像或连续检测过程中信号的稳定性。 三、主要应用领域1.蛋白质标记与示踪：广泛用于标记抗体、酶、受体蛋白等，制备荧光探针用于WesternBlot、免疫荧光染色、免疫组化、流式细胞术、免疫沉淀及活细胞成像等，以研究蛋白质的表达、定位、相互作用及动态变化 4.生物传感与诊断开发：作为信号报告分子，用于构建荧光免疫检测试剂、生物传感器或即时检验试纸条，提升检测的灵敏度与特异性。 -温度：通常在4°C至室温下进行，低温有助于维持蛋白质稳定性。
10610编辑于 2026-02-03pHAb Thiol Reactive Dye：精准高效的巯基反应性荧光标记工具
4.良好的生物相容性：标记反应条件温和，通常在近中性缓冲液中进行，对蛋白质构象和生物活性的影响较小，适用于制备功能性荧光探针。 三、主要应用领域1.蛋白质标记与功能研究：-用于特异性标记抗体、酶、受体等蛋白质，制备高特异性荧光探针。-应用于蛋白质-蛋白质相互作用研究、细胞表面受体动态追踪、活细胞内蛋白质定位与转运分析。 4.生物传感与诊断试剂开发：-作为信号报告分子，用于构建基于荧光共振能量转移的生物传感器或高灵敏度免疫检测试剂。 -反应温度和时间根据实验需求优化（通常室温30分钟至4℃过夜）。3.产物纯化与表征：-通过脱盐柱、透析或高效液相色谱去除未反应的染料。 4.存储与稳定性：染料原液应避光、干燥、低温保存；标记后的产物建议分装并添加稳定剂（如牛血清白蛋白）后于-80℃长期保存。
16110编辑于 2026-02-03一种基于双功能核仁素蛋白的“信号增强”型荧光纳米探针用于单细胞成像研究
二、核心工具：BiotinylatedNucleolin/NCLHis&AviTag蛋白在探针构建中的关键作用在开发新型靶向成像探针的过程中，获得高纯度、结构完整且便于偶联的功能性靶标蛋白是验证探针性能的基石 2.高效生物素化：预生物素化的蛋白可通过其生物素（Biotin）与链霉亲和素（Streptavidin）之间高达皮摩尔级的超强非共价结合，实现与各类载体（如纳米颗粒、荧光染料、磁珠）的快速、稳固且取向可控的偶联 三、智能"信号增强"型荧光纳米探针的设计与性能基于上述工具与策略，研究团队成功构建了一种用于原位监测核仁素的智能荧光纳米探针。 其核心创新在于“信号增强”机制：当探针未结合靶标时，荧光分子因受AuNPs表面能量转移效应而处于淬灭状态（“关闭”）；一旦AS1411与细胞表面或内部的核仁素结合，探针构象发生改变或与靶标蛋白的距离拉近 在体外测试中，其荧光强度与核仁素浓度在4-21nM范围内呈良好的线性关系，并能有效区分核仁素与多种常见细胞内物质。
9810编辑于 2026-01-29- 来自专栏Youngxj
canvas荧光表源码分享
148); context.lineTo(x2*135,y2*135); } context.strokeStyle='green'; context.lineWidth=4; context.moveTo(0,8); context.lineTo(0,-105); context.strokeStyle="green"; context.lineWidth=4;
78230发布于 2018-06-07 - 来自专栏聊点学术
【附加篇】免疫荧光相关的注意事项
但是，想要得到良好的结果却很难，大家经常会遇以下问题： （1）目标蛋白的荧光很弱，导致组间差异并不明显，造成假阴性结果； （2）蛋白荧光太强，甚至形成非特异性的标记，一些背景染色可能被误认为阳性区域，造成假阳性结果 ； （3）DAPI染细胞核时，加入的试剂太多，造成高背景染色； （4）组织切片预处理不当或采用石蜡切片，导致高背景染色； （5）采集图像过程不当，导致原始图像不佳，直接影响后续半定量分析。 . ---- 问题分析： （1）目标蛋白的荧光很弱，导致组间差异并不明显，造成假阴性结果 这种情况出现后，首先要检查一下抗体对不对，是否适用于你的预处理组织。 （2）目标蛋白的荧光太强，甚至形成非特异性的标记，一些背景染色可能被误认为阳性区域，造成假阳性结果 这种情况一般出现在抗体浓度过高而漂洗又不充分的时候。 （4）组织切片预处理不当或采用石蜡切片，导致高背景染色 如果组织切片，尤其是石蜡切片脱蜡环节不彻底，也会造成区域性的非特异性标记。建议脱蜡一定要彻底，脱蜡前充分烤片也可以帮助脱蜡。
2.7K20发布于 2020-12-11 - 来自专栏生命科学
Cyanine 染料 | MedChemExpress
CY 花菁类染料优点1) 光谱窄，信号强；2) 花菁类染料的摩尔吸光系数高于其他荧光染料；3) 磺化花菁类染料易溶于水，对组织细胞毒性小，适用于动物和细胞实验；4) 荧光波段在近红外区段的组织透过性更好 Cy 3 Non-Sulfonated555/580Cy3-N3 是 Cy3 叠氮化物荧光染料，用于多肽、蛋白和寡核苷酸中的氨基。 Cy5659/670Cy5 是明亮的红色荧光染料，用于标记肽，蛋白质，寡核苷酸的氨基基团的反应染料。 Cy5.5673/707Cy5.5 (Sulfo-Cyanine5.5) 是用于标记生物分子的近红外荧光染料，可用于小动物体内成像，也常常适用于对背景荧光干扰的实验。 Cy7-SE720/790CY7-SE (Sulfo-Cyanine7 Succinimidyl Ester) 是一种近红外荧光标记试剂，常用于小动物体内成像，也用来标记核酸，蛋白，多肽，纳米粒，多聚物等
30720编辑于 2023-01-10 - 来自专栏生命科学
MCE | 自噬检测
在文章中，使用了 WB 检测蛋白、免疫荧光，mCherry-eGFP-LC3B 双荧光系统的组合测量方法，检测 p27+/+和 p27-/- MEFs 自噬流。 氯喹处理细胞后，在短期氨基酸剥夺的条件下(0-4 h)，两种细胞的自噬通量是相似的(图 4a, b)。 (3) mCherry-eGFP-LC3B 双荧光系统检测自噬体与自噬溶酶体。mCherry (红光)-eGFP (绿光)-LC3B 串联荧光蛋白可用于检测自噬流水平的融合蛋白。 因此若细胞内出现绿和红色荧光共定位，即出现黄色荧光时，表明：mCherry-eGFP-LC3B 融合蛋白并未与溶酶体发生融合, 说明了自噬流被阻断。 当细胞内仅出现红色荧光而无绿色荧光时，代表 mCherry-eGFP-LC3B 融合蛋白定位于溶酶体或自噬溶酶体内，即自噬流活化。
79620编辑于 2023-03-16 - 来自专栏生信课程note＋实验知识
实验知识-230910
4.TBST缓冲液，即TBS with Tween-20，是生物学中常使用的等渗缓冲盐溶液，由Tris-HCl构成稳定的pH缓冲体系，NaCl提供等渗条件，Tween-20作为去污剂可增加缓冲液的洗脱能力 酸提法可以用来提取组蛋白，因为组蛋白是偏碱性的。 操作步骤包括用一半体积的 TEB 洗涤细胞核，然后在0.2 N HCl中重悬沉淀，密度为每毫升 4 x 10 7 个细胞核，最后在 4℃ 下用酸法提取组蛋白过夜。 14.免疫外科法是指什么在人类胚泡的ICM中发现了ES细胞，这是在受精后第4天到第7天，胚胎生长的早期阶段。胚泡是指在着床前胚胎发育的阶段，它包含两种细胞。 滋养外胚层处于外层，提供额外的胚胎膜。 13.物镜调到4×，左下光最低，光旁边开关关，右后关。针放利器盒。细胞间：质粒 DNA 和其他包装质粒共转染细胞（293T 细胞）产生病毒，即为病毒包装。
2.3K30编辑于 2023-09-10 - 来自专栏DrugOne
Nat. Commun. | 微流控+AI系统问世：千滴同测，为生物制造降本增效
通过应用DropAI，研究团队显著简化了大肠杆菌CFE系统的组成，使超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）的单位成本降低了4倍。这个优化配方在12种不同蛋白质上得到进一步验证。 研究团队首先在大肠杆菌CFE系统上应用DropAI，筛选了12种添加剂的组合，最终优化后的配方使超折叠绿色荧光蛋白的单位成本降低2.1倍，产量提高1.9倍。 研究人员使用三种不同的荧光标记来追踪这些成分的组合，并通过测量绿色荧光蛋白的表达量来评估每种组合的效果。 如图4所示，研究人员设计了125种不同的浓度组合，并通过荧光标记系统追踪每种组合。系统总共收集了近5万个微型反应器的数据。 结果显示，大多数蛋白质的表达水平都得到了维持或提高，其中TxtE蛋白的表达量甚至提高了4.5倍。虽然个别蛋白质的表达量略有下降，但通过与荧光蛋白融合的方式可以改善其表达。
50210编辑于 2025-03-31 - 来自专栏百味科研芝士
如何对荧光共定位进行定量分析？
荧光共定位是很常见的实验方法，一般用来验证2种或3种蛋白是否存在共定位关系。在常规Protocol的指导下进行实验操作，很容易得到双荧光或多重荧光染色图像。 ? 这种图像，一般由红色通道（代表蛋白A）和绿色通道（代表蛋白B）两种图像merge后得到。 ? （红色通道：蛋白A） ? （绿色通道：蛋白B） 仅仅通过肉眼和语言描述是很难说清楚蛋白A和蛋白B的共定位程度到底如何。因此，我们需要对这种共定位关系进行定量分析。 4.点完后，我们会得到一张图像。 （这是红色通道-绿色通道性形成的散点图，可以看出散点几乎都落在对角线上，说明红绿通道相关性极强，且红绿通道荧光强度基本相当。） ? 5. 7.总结一下，操作后我们得到红绿通道散点图、皮尔逊相关系数以及重叠系数，这三个要素是报告荧光共定位分析的最重要的数据，必须在论文中报告。
1.2K20发布于 2020-09-22 - 来自专栏量子化学
荧光光谱的理论计算
荧光光谱有如下特征： (1) Stokes位移 荧光发射波长总是比相应的吸收光谱的波长长，称为Stokes位移，如下图所示。 ? (3)步： %chk=c153.chk #p opt pbe1pbe/6-311G** td scrf=(solvent=cyclohexane) geom=allcheck guess=read (4) 态特定模型下的荧光发射光谱计算，分两步完成： (4-1) 在激发态的平衡结构下做TD计算，得到激发态的能量，并写将溶剂信息写入chk文件： %chk=c153.chk #p pbe1pbe/6-311G ** td scrf(solvent=cyclohexane,noneq=write,externaliteration) guess=read geom=allcheck (4-2) 在激发态的平衡结构下做基态计算 ，严格符合荧光的定义，结果为2.73 eV。
7.2K30发布于 2020-07-27 【免疫学实验】抗体标记与显微成像技术全解析
一、 免疫荧光显微成像 利用荧光染料（荧光色素或荧光团）标记抗体本身，或用于检测抗体的抗免疫球蛋白抗体，再用显微镜检测，这种技术称为免疫荧光显微成像。 1. 间接法： 先使用未标记的一抗结合抗原，再利用荧光标记的二抗（抗免疫球蛋白）进行检测。 3. 常用荧光染料荧光染料被特定波长的光（通常是蓝光或绿光）激发后，会发出不同波长的可见光。 最常用的包括： 发出绿光： 荧光黄 发出红光： 德州红、多甲藻素-叶绿素-蛋白质复合物（PerCP） 发出橙色/红色光： 罗丹明、藻红蛋白（PE） 通过将不同染料附着到不同抗体上，我们可以在同一细胞或组织切片中 优势： 提供亚微米级的高分辨率，图像比传统荧光显微镜更清晰，并能建立三维图像。 应用： 可用于研究固定细胞或表达荧光蛋白（如GFP、RFP等）的活细胞。 在免疫学中，延时双光子荧光成像具有特别重要的意义。它可以在完整淋巴器官和淋巴组织中，实时跟踪荧光蛋白标记的T细胞和B细胞，以及它们相互作用的具体位置。
23910编辑于 2025-12-29
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