目前已经描述的细胞死亡方式有十几种,包括调节性细胞死亡如细胞凋亡、焦亡、坏死性凋亡、铁死亡、Entosis、NETosis、Parthanatos、溶酶体依赖性细胞死亡、自噬依赖性细胞死亡、Alkaliptosis 细胞凋亡 细胞凋亡是程序性细胞死亡的最佳表征形式,不会引起炎症反应,对器官发育、组织重塑、免疫反应和肿瘤抑制至关重要。 当凋亡细胞在经历细胞凋亡后没有被吞噬时,也可能导致坏死,这一过程称为继发性坏死 (此过程由特定的生化途径控制的)。 坏死性凋亡 是一种受调节的细胞死亡形式。它死亡的方式比较有“创意”,既以坏死的形态为特征,如细胞肿胀和破裂,又与细胞凋亡类似,由确定的信号通路控制。 Drug Resist Updat. 2009;12(3):55-64. 4. Ichim G, Tait SW.
基于这些特征,多种检测凋亡的方法也迅速发展起来,常用的方法包括形态学检查,分子生物学方法,免疫电泳和细胞学检查。更多关于细胞凋亡的知识可阅读文章:医学科研实验基础知识笔记(二):细胞凋亡检测。 样品处理 在标有实验组,阳性对照组和阴性对照组的切片上滴加 4%不含甲醇的甲醛室温固定 10min。弃去甲醛,用 PBS 洗两次,每次 5min。 在光学显微镜下,结合 3 组结果分析,经过 DAB 和苏木素复染后,凋亡细胞 核被染成棕黄色,正常细胞核呈蓝色。可通过实验组凋亡细胞数判断凋亡水平。 目前流式细胞仪检测细胞凋亡已逐渐成为趋势,利用Annexin V-FITC和PI染色, 流式细胞仪检测早期凋亡率。Annexin V -FITC检测凋亡。 正常细胞带负电的磷脂酰丝氨酸(PS)定位于细胞膜内侧。细胞凋亡早期,由于细胞膜失去对称性, PS从包膜的内侧暴露于细胞膜外,成为巨噬细胞清除凋亡细胞识别的标志。
细胞凋亡的主要特征是:(1) 电子致密核 (早期边缘化);(2) 核碎裂;(3) 完整的细胞膜;(4) 杂乱无章的细胞质、 细胞器;(5) 大而透明的空泡;(6) 细胞表面有气泡。 如 Figure 4 所示,TEM 显示 BBR (小檗碱) 或 DDP (顺铂) 诱导大量 OVCAR3 细胞凋亡。变化主要包括细胞 质皱缩、质膜起泡、染色质浓缩和凋亡小体形成。 透射电镜的主要缺点是成本高,一次只能检测一小块区域,难以及早发现凋亡细胞[1][5]。Figure 4. 孵育结束后,400 ×g 4℃ 离心 3-4 分钟,沉淀细胞,弃上清。4. 用 PBS (1×) 洗涤 2 次:加入 2 mL PBS (1×) 重悬细胞,400 ×g 4℃ 离心 3-4 分钟,沉淀细胞,弃上清。5. 用 500 μL 的 PBS (1×) 重悬细胞。6.
细胞凋亡(Apotosis) 细胞凋亡是发现最早 与细胞坏死过程中发生的核溶解和细胞肿胀破裂不同,细胞凋亡的主要形态学特征为染色质固缩、DNA 片段化、细胞膜起泡、细胞皱缩、凋亡小体的形成等。 一旦 caspase-8 激活,细胞凋亡的执行阶段就被激活。细胞凋亡的内源性途径则是由线粒体事件启动的,由胞内的信号刺激产生,并直接作用于胞内的靶点。 活化后的caspase-1, 4, 5 可以将 GSDMD 的两个结构域切割开,被释放的 N 端结构域会在细胞膜的表面聚集起来,形成孔道。 而炎性 caspases 则主要在细胞焦亡过程中起作用,包括 caspase-1,4,5;此外,小鼠的 caspase-11 也被报道在细胞焦亡中发挥与人类 caspase-4,5 类似的作用。
细胞凋亡的检测细胞凋亡,我们该如何检测呢?目前至少有数十种检测细胞凋亡的方法,可以大致划分为基于细胞形态、生物学功能和生化标记三大类。 细胞凋亡的主要形态学特征包括:染色质固缩、DNA 片段化、细胞膜起泡、细胞皱缩、凋亡小体的形成等。 注:泳道 1-4 分别表示 0 pM、8.33 pM、333.33 pM 和 666.67 pM MCP30 诱导 72h 的 Ishikawa H 细胞3.3 DNA 片段原位检测 (TUNEL 法) 细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒采用碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) 染色的方法检测细胞周期和细胞凋亡。 Molecules. 2022, 27(4): 1313.4. Xu K, Park D, Magis AT, et al.
AG825 能明显加速人中性粒细胞的凋亡。AG-825 是一种潜在的克服锰诱导的神经毒性或阿尔茨海默病 (AD) 发展的药物。 ErbB2 是 ErbB 酪氨酸激酶受体 (RTK) 家族的成员。 在 SKBR3 和 MDCK 细胞中,AG-825 和 GroA 的联合使用显著降低细胞存活率,促使细胞死亡,且对细胞集落形成具有长期影响,显著减少了两个细胞系菌落的总面积,优于两者单一处理效果。 在三维立体培养中,GroA 和 AG-825 均能干扰 SKBR3 细胞非锚定依赖的生长能力,两者共处理干扰效果更好,还能显著减少通过 Cultrex 基底膜侵入的细胞数,但不影响细胞生长形态。 BAY 61-3606 降低神经母细胞瘤细胞中的 ERK1/2 和 Akt 磷酸化。BAY 61-3606 降低 K-rn 细胞裂解物中 Syk 磷酸化。 Bay 61-3606 作用于乳腺癌细胞,通过下调 Mcl-1 促进 TRAIL 诱导的细胞凋亡。 Bay 61-3606 通过两种调节 Mcl-1 的机制使细胞对 TRAIL 敏感。
细胞凋亡之所以成为人们研究的一个热点,在很大程度上决定于细胞凋亡与临床病毒的密切关系。 流式细胞仪法检测海马神经元凋亡率:取1ml细胞,1000rpm,4℃离心10分钟,弃上清。加入冷的PBS液1ml,轻轻震荡使细胞悬浮,1000rpm,4℃离心10分钟,弃上清,重复此步骤两次。 4. 应用该法可降低晚期凋亡和坏死比例,增加早期凋亡细胞比例。 3. 由于Annexin-V为钙离子依赖的磷脂结合蛋白,只有在钙离子存在的情况下与PS的亲和力才大,因而在消化细胞时,建议一般不采用含EDTA的消化液。 4. 必须设置阴性对照和补偿对照(分别单染)。
大多数肿瘤对细胞凋亡具有先天抵抗力,所以诱导细胞死亡机制而非细胞凋亡已逐渐成为一种新的癌症治疗策略。最近,一些研究揭示了不同的细胞死亡机制和抗肿瘤免疫之间的相互影响。 诱导细胞焦亡、铁死亡和坏死性凋亡与免疫检查点抑制剂(ICIs)联合显示出协同增强的抗肿瘤活性,即使在 ICI 抗性肿瘤中也是如此。细胞焦亡、铁死亡和坏死性凋亡有何不同?其相应的ICI分别有哪些? 酰基辅酶A合成酶长链家族成员4 (ACSL4)通过塑造细胞脂质组成来决定铁死亡的敏感性。从机制上讲,ACSL4 富含长多不饱和ω6脂肪酸的细胞膜,这些脂肪酸容易受到铁死亡的影响。 谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)是一种在其催化中心含有硒代半胱氨酸 (Sec) 的硒蛋白,需要有效还原过氧化磷脂。因此,低GPX4表达水平与对铁死亡的敏感性增加有关。 尽管肿瘤细胞坏死性凋亡似乎是肿瘤清除的有利因素,但一些经历坏死性凋亡的细胞无法解释坏死性凋亡诱导剂的整个抗肿瘤作用,表明坏死性凋亡与抗肿瘤免疫之间存在潜在联系。
[4]。 流式细胞术显示 C666-1 和 HK-1 细胞中 MUC-16 的缺失诱导了细胞凋亡[4]。a. 活细胞中,不可检测到 Annexin V-FITC/PI 的荧光。 加入 195 μL Binding Buffer,轻轻重悬细胞。3. 加入 5 μL Annexin V-FITC,轻轻混匀。4. 加入 10 μL PI Stain,轻轻混匀。5. 文献中为了检测人参皂苷 Rd 在高糖条件下对细胞状态的影响,利用 JC-1 (HY-15534) 检测线粒体膜电位变化[6]。图 4. 4. 用 1 mL JC-1 工作液重悬细胞,于 37℃,5% CO2 培养箱孵育 15-30 min。5. 室温条件 400 g 离心 5 min;吸掉上清。6.
GSM7306057_sample4_barcodes.tsv.gz"[11] "01_data/sample4/GSM7306057_sample4_features.tsv.gz"[12] "01_ 红细胞基因:在某些情况下,红细胞基因可能在特定类型的细胞(如红细胞)中高度表达,这可能会影响对其他细胞类型基因表达的分析。但是有些测量红细胞基因表达离群值太大或者太小那肯定不对,需要删除这样的。 sample5 sample6 687 622 683 686 677 674 画了核糖体,但是没有用这个,轻微的用了一下红细胞基因4 整合降维聚类分群整合 将高维数据映射到低维空间中聚类分群:聚类分群的目的是将相似的细胞聚集在一起,形成不同的细胞群体或亚群,这些群体可能代表不同的细胞类型或状态。 我理解的就是control中nk和其他细胞的差异基因,和treat和其他细胞之间的差异基因,他俩取交集就是无论在control和treat组中NK和其他细胞都有差异的基因,这个会叫NK和其他细胞的差异保守的基因
象限划分左下象限(Q4:AnnexinV⁻/PI⁻):活细胞。细胞未被染色或仅有很低的自发荧光。右下象限(Q3:AnnexinV⁺/PI⁻):早期凋亡细胞。 关键参数与报告:总凋亡率:Q3%(早期凋亡)+Q2%(晚期凋亡)早期凋亡率:Q3%(早期凋亡)晚期凋亡/坏死率:Q2%(晚期凋亡)坏死/损伤率:Q1%(坏死)存活率:Q4%(活细胞)解读示例:对照组:Q4 凋亡诱导组:-如果药物/处理主要诱导早期凋亡:Q3(早期凋亡)比例显著升高,Q2(晚期凋亡)可能略有升高,Q4(活细胞)降低。 -如果处理时间较长或作用较强:Q2(晚期凋亡)比例显著升高,Q3(早期凋亡)可能仍然较高或开始下降(细胞进入晚期),Q4(活细胞)显著降低。 关键定量分析:-活细胞率(%,Q4-AnnexinV⁻/PI⁻)-早期凋亡率(%,Q3-AnnexinV⁺/PI⁻)-晚期凋亡/坏死率(%,Q2-AnnexinV⁺/PI⁺)-总凋亡率(%,Q3+Q2,
产品介绍一步法 TUNEL 原位细胞凋亡检测试剂盒(红色,Elab Fluor® 594/绿色,Elab Fluor® 488)是 Elabscience 推出的高效凋亡检测工具,专为晚期凋亡细胞的 DNA DNA 片段化作为晚期凋亡的标志性特征 —— 凋亡细胞内激活的特异性 DNA 内切酶会将基因组 DNA 切割为 180~200bp 的阶梯状片段,成为判断细胞凋亡状态的核心依据。 信号检测:标记后的凋亡细胞会发出红色荧光,通过荧光显微镜观察红色荧光信号,即可实现对晚期凋亡细胞的原位定位与检测,常搭配 DAPI(蓝色荧光)进行细胞核复染以辅助判断。 应用领域一步法TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒适配多种样本类型,广泛应用于基础科研与病理研究场景:基础细胞生物学:体外培养细胞(如 Hela 细胞)凋亡诱导效率检测、基因敲除 / 过表达对细胞凋亡的影响研究 病理组织分析:石蜡切片(如大鼠心脏、脑、小鼠肺组织)、冰冻切片的凋亡细胞定位,助力疾病相关病理机制探索。毒理学研究:重金属、药物等外源物质诱导的细胞凋亡评估,如福寿螺幼螺毒理实验中的凋亡检测。
一、细胞凋亡检测的生物学意义细胞凋亡是生物体内一种高度保守的程序性细胞死亡方式,在胚胎发育、组织稳态维持、免疫系统功能调节以及疾病发生发展等众多生理病理过程中发挥关键作用。 二、AnnexinV-FITC/7-AAD检测法的核心原理该检测方法基于细胞凋亡过程中发生的早期关键事件------磷脂酰丝氨酸外翻和细胞膜完整性丧失,实现了对活细胞、早期凋亡细胞及晚期凋亡/坏死细胞的精确区分 4.适用于多种样本类型:广泛适用于悬浮细胞(如淋巴细胞、肿瘤细胞系)和贴壁细胞(经温和消化处理后)的凋亡检测,也可用于某些原代细胞的检测。 3.免疫学研究:检测T细胞、B细胞等免疫细胞的活化诱导凋亡,研究免疫耐受与自身免疫病的机制。4.毒理学与安全性评价:评估环境毒素、化学药物或纳米材料对细胞的潜在毒性及其诱导凋亡的能力。 4.关键注意事项:-避免使用含有EDTA或消化酶(如胰酶含有)的缓冲液处理细胞,以免干扰AnnexinV与钙离子的结合或损伤细胞膜。-操作过程需轻柔,避免剧烈的涡旋或吹打,防止机械损伤导致假阳性。
考虑到凋亡蛋白抑制因子的上调导致了肿瘤对硼替佐米的耐药性,作者在磷酸肽中引入了与凋亡蛋白抑制因子结合的基序(AVPI),能够在细胞内自组装并与凋亡蛋白抑制因子作用。 这些碱性磷酸酶响应性肽组装体不仅阻断了肿瘤细胞中的凋亡蛋白抑制因子以增强硼替佐米的疗效,而且还将硼替佐米重新定位到溶酶体中以降低对正常细胞的毒性。 胶束通过小窝蛋白依赖性的内吞作用进入肿瘤细胞,主要定位于内质网,形成组装体,阻断凋亡蛋白抑制因子,从而显著增强硼替佐米诱导的肿瘤细胞凋亡。 相比之下促凋亡肽和硼替佐米的胶束通过巨胞饮作用进入HS-5细胞,定位于HS-5的溶酶体中,从而阻断了硼替佐米对其靶点(蛋白酶体)的作用,降低了硼替佐米的毒性。 本工作中报道的磷酸肽不仅组装成纳米纤维使癌细胞中的凋亡蛋白抑制因子失活,而且还将正常细胞从抗肿瘤药的副作用中解救出来。
3.凋亡通路核心分子家族成员介绍(1)Bcl-2家族Bcl-2家族最有代表性的家族成员就是Bcl-2分子。Bcl-2分子内含有四个同源结构域,分别是BH1-BH4。 这一类Caspase分子与细胞凋亡的关系不是很密切,可能与多种炎症因子或者细胞因子的成熟有关。4.介导凋亡的通路介导凋亡的通路有三条:分别是线粒体通路;内质网通路和死亡受体通路。 已知的死亡受体有五种:1)TNFR-1(又称CD120a或p55);2)Fas(又称为CD95或Apo1);3)DR3(死亡受体3deathreceptor3,又称Apo3);4)DR4(死亡受体4,又被称为 ;3)AnnexinV阳性且PI阳性(双阳性细胞),这类细胞是晚期凋亡或者是坏死的细胞;4)AnnexinV阴性且PI阳性,这种情况可能是由于非特异性染色导致的。 在凝胶电泳中,如果出现这种特征性的电泳条带,就可以判断细胞发生了凋亡。(4)凋亡明星分子检测通常检测明星分子,采用的是Western Blot的方法检测蛋白。
这些算法的目标是学习数据集中的底层结构,以便将相似的细胞放在低维空间中。因此,在上面确定的基于图的簇内分组在一起的细胞应该在这些降维图上共同定位。 特别是,这些方法旨在保留数据集中的局部距离(即确保具有非常相似的基因表达谱的细胞共定位),但通常不会保留更多的全局关系。 默认情况下,与所有其他细胞相比,它识别单个簇的阳性和阴性标记(在 ident.1 中指定)。 = c("NKG7", "PF4"), slot = "counts", log = TRUE) FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "GNLY", "CD3E 在此数据集的情况下,可以使用规范标记轻松地将无偏聚类与已知细胞类型进行匹配: new.cluster.ids <- c("Naive CD4 T", "CD14+ Mono", "Memory CD4
例如,凋亡细胞的 ATP 或 AMP 可转化为腺苷,腺苷再通过腺苷受体抑制炎症,上调抗炎 (anti-inflammatory) 和促消炎 (pro-resolution) 基因表达 (包括 Nr4a1 吞噬细胞迁移到凋亡细胞附近后,表面受体识别凋亡细胞的 “Eat me” 信号,与之结合。 凋亡细胞本身也能改变吞噬细胞的免疫代谢 (图 4):(1) 凋亡细胞表面的 PS 与受体结合后能激活或上调 LXR 和 ABCA1,可促进胆固醇的代谢与输出;(2) 凋亡细胞线粒体的脂肪酸氧化可促进抗炎因子 IL-10 的表达;(3) 吞噬细胞利用凋亡细胞的精氨酸 (Arginine) 驱动肌动蛋白细胞骨架重排,促进之后几轮的凋亡细胞摄取;(4) 糖酵解与葡萄糖输入的增加也促进 ATP 生成和肌动蛋白聚合 但由于凋亡细胞易被清除,在体内检测仍是个巨大的挑战。不过,办法总比困难多嘛~Raymond 等人开发了一种基因编码的荧光报告基因 CharON,实现了在果蝇胚胎发育过程中胞葬作用的活细胞追踪[4]。
SN-38可通过稳定拓扑异构酶I-DNA断裂复合物,阻止DNA单链断裂的重新连接,进而诱导细胞的凋亡[1]。并且,SN-38还可以诱导细胞的氧化应激和线粒体凋亡通路的激活[2]。 SN-38对多种肿瘤细胞系(如HT1080、HCT116、A204等)表现出显著细胞毒性。 在动物模型中,SN-38与抗PD-1抗体(Recombinant Anti-Mouse PD1 mAb)联用显著抑制了小鼠肿瘤生长,机制涉及增加肿瘤内NK细胞和CD8+ T细胞浸润[4]。 Molecular pharmaceutics 2022, 19 (6), 1866-1881.[4] Lee, Y. M.; Chen, Y. H.; Ou, D. L.; et al. The Journal of pathology 2023, 259 (4), 428-440.[5] Kciuk, M.; Marciniak, B.; Kontek, R.
坏死性凋亡代表了发现的第一个介导坏死的程序性细胞死亡机制。 在凋亡缺陷条件下,死亡受体包括TNFR1、Fas、DR4和DR5,被其相应的配体激活,可以促进坏死性凋亡。 巨噬细胞的吞噬作用涉及通过各种PtdSer受体如TIM4、TAM酪氨酸激酶受体、MFGE8、GAS6和蛋白质S对凋亡细胞的识别。 GPX4的失活会导致活性氧种(ROS)的过量产生,引发脂质过氧化,破坏质膜和线粒体膜,从而激活细胞死亡。 在小鼠中可诱导GPX4失活,导致脂质氧化引起的急性肾功能衰竭和动物死亡。 多不饱和脂肪酸的脂质过氧化,是细胞ROS增加的一个后果,产生反应性醛,如4-羟基壬烯醛(4-HNE),它能够以细胞类型和浓度依赖的方式与蛋白质、脂质和DNA形成加成物。 此外,正如4-HNE水平的升高所指示的,脂质过氧化的积累可能导致细胞损伤和铁死亡。
他们发现放射线会增加鳞状细胞癌的细胞凋亡率,而卵巢切除术会增加大鼠乳癌的细胞凋亡率,从而预见诱导凋亡的方法可以用来治疗癌症。最初,很少有研究人员注意到他们的工作,但是在80年代后期,情况发生了变化。 相反,一些细胞通过凋亡作为应激反应来响应药物引起的变化。诸如DNA损伤反应和内质网应激反应等应激反应可以触发细胞凋亡。例如,通过增加促凋亡的BH3蛋白的转录和转录后过程(图3)。 图4.促凋亡的BH3蛋白是通过多种抗癌药物杀死肿瘤细胞的关键启动者 许多癌细胞带有缺陷,例如p53中的突变,这些缺陷会损害BH3蛋白的表达,而BH3蛋白对于响应抗癌药启动细胞凋亡至关重要。 然而,可以想象,该过程也可能导致有害杀死健康细胞。尽管已显示TRAIL受体DR3和DR4的激动剂(即TRAIL本身或受体激活抗体)可杀死培养和体内的某些癌细胞,但这些试剂的临床试验尚未取得实质性进展。 免疫疗法,免疫检查点抑制剂和CAR T细胞疗法 CTL和NK细胞在杀死病毒感染的细胞中起关键作用,也可以自发地或通过使用免疫检查点抑制剂(例如阻断CTLA4,PD1或其配体PD-L1的抗体)来触发这种活性以杀死癌细胞