刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)因具有特异性糖链识别能力,被广泛用于糖蛋白、多糖以及细胞相关研究。 关键词:刀豆蛋白A磁珠, Concanavalin A磁珠, 糖蛋白分离磁珠, 凝集素磁珠, BioMag Plus ConA, 磁珠法糖蛋白纯化, CUTRUN磁珠, CUT&Tag磁珠一、为什么Concanavalin 刀豆蛋白A(Con A)属于植物凝集素的一种,可特异性识别α-D-葡萄糖以及α-D-甘露糖末端结构,因此被广泛用于含糖基化结构的蛋白、多糖以及细胞分离研究。 ConA磁珠能够高效结合通透细胞及细胞核,因此已被广泛应用于CUT&RUN相关流程。Q4:适用于哪些样本?包括血清、血浆、细胞裂解液、组织匀浆、外泌体以及微生物样本等。 A磁珠、BioMag Plus Concanavalin A、Con A磁珠、糖蛋白/多糖富集磁珠、CUT&RUN与CUT&Tag相关参考文献、技术应用文章曼博生物整理,支持糖生物学、表观遗传、免疫与蛋白质研究相关应用
本文围绕Polysciences三款具有代表性的工具——BioMagPlusConA刀豆蛋白A磁珠、FastBlue快蓝以及水性荧光封片剂展开介绍,并分析其在糖生物学、表观遗传、神经科学以及荧光成像等研究中的应用特点 关键词:刀豆蛋白A磁珠、ConcanavalinA磁珠、FastBlue、快蓝、荧光封片剂、水性封片剂、Polysciences一、BioMagPlusConA刀豆蛋白A磁珠:糖生物学与表观遗传研究的重要工具刀豆蛋白 A磁珠(ConcanavalinA磁珠)是Polysciences具有代表性的磁性分离产品,其通过将ConA共价固定于磁性微球表面,同时兼具糖蛋白富集与细胞核捕获功能,因此在糖生物学以及表观遗传研究中被广泛使用 图1.使用BioMagPlusConA磁珠对脱铁运铁蛋白的结合和洗脱BioMagPlusConA磁珠主要具有以下特点:配体采用共价偶联固定,稳定性较高微球粒径均一,磁响应速度快即用型设计,无需复杂预处理可兼容自动化平台与高通量实验 关于技术来源本文内容基于Polysciences刀豆蛋白A磁珠、fastblue、快蓝、荧光封片剂、水性封片剂等公开技术资料、参考文献曼博生物整理,用于科研技术交流和实验参考。
关键词:CUT&RUN、CUT&Tag、ConA磁珠、刀豆蛋白A磁珠、BioMagPlusConcanavalinA、CUT&RUN磁珠、CUT&Tag磁珠、糖蛋白磁珠、表观遗传研究一、ConA磁珠在CUT 刀豆蛋白A(ConcanavalinA,ConA)属于植物凝集素的一种,具有较强的糖基识别能力,可特异识别α-D-葡萄糖和α-D-甘露糖相关结构,因此长期用于糖蛋白、多糖以及细胞表面相关组分研究。 4、糖生物学基础研究可用于凝集素-糖相互作用研究、糖基化分析以及潜在生物标志物筛选。 TagtoidentifycellstatesinnormalanddiseasetissueSingle-cellCUT&Taganalysisofchromatinmodificationsindifferentiationandtumorprogression关于技术资料来源本文基于刀豆蛋白 A磁珠、BioMagPlusConcanavalinA、ConA磁珠、糖蛋白/多糖富集磁珠、CUT&RUN与CUT&Tag相关参考文献、技术应用文章曼博生物整理,支持糖生物学、表观遗传、免疫与蛋白质研究相关应用
磁珠目前,超顺磁性微珠已经大幅取代琼脂糖珠,成为免疫沉淀和其他微量亲和纯化方法的首先选择。与琼脂糖珠不同,磁珠是固体,抗体的结合仅限于磁珠的表面。 磁珠 (直径 1-4 μm)明显小于琼脂糖珠,尽管磁珠没有多孔中心增加结合能力,但每体积的磁珠数量比琼脂糖珠多,使磁珠拥有足够的抗体结合表面积满足高容量的抗体结合。 相反,绑定在磁珠表面的抗体均能与目的蛋白结合,并且抗体很少会在温和的洗涤步骤(磁性分离)中流失。另外,琼脂糖珠的非特异性结合能力大于磁珠。 磁珠:采用磁性分离,无需设定最小体积的的磁珠使用量,用量仅取决于目的蛋白和免疫沉淀抗体。 在日常小型分离特定蛋白质和蛋白复合物时,以及进行手动和自动化标准 IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP 和 Pull-down 反应并立即用于后续检测分析时,磁珠是最佳选择。
磁珠的作用在成品电路板上,我们会看到一些导线或元件的引脚上套有黑色的小磁环,这就是本文要介绍的磁珠。 磁珠的全称为铁氧体磁珠滤波器(另有一种是非晶合金磁性材料制作的磁珠),是一种抗干扰元件,滤除高频噪声效果显著。 铁氧体磁珠广泛应用于印制电路板,如在印制板的电源线入口端套上磁珠(较大的磁环),就可以滤除高频干扰。 铁氧体磁环或磁珠专用于抑制信号线、电源线上的高频干扰和尖峰干扰,它也具有吸收静电放电脉冲干扰的能力。 电感是储能元件,而磁珠是能量转换(消耗)器件。 磁珠用来吸收超高频信号,例如在一些RF电路、PLL、振荡电路、含超高频存储器电路等,都需要在电源输入部分加磁珠。 磁珠的单位是欧姆,是按照它在某一频率下产生的阻抗来标称的。
预处理样品:通过将裂解样品单独与珠子或与无关抗体结合,以除去能与 IP 组分非特异性结合的任何蛋白质。 Step 3. 使用针对目的蛋白的抗体孵育溶液,用直接法或用间接法将抗体固定在磁珠上。 继续孵育,以形成抗体-目的蛋白复合物。 Step 4. 沉淀微珠-抗体-目的蛋白复合物,去除上清液。 Step 5. 洗涤沉淀的复合物数次。使用磁珠时,每次洗涤置于磁性分离架上即可除去上清液。 使用低 pH 或 SDS 样品上样缓冲液从磁珠上洗脱蛋白质。 Step 7. μL细胞裂解液 IP/Co-IP/蛋白纯化 HY-K0206 Anti-c-Myc Magnetic Beads 10 μL 磁珠/ 500 μL细胞裂解液 IP/Co-IP/蛋白纯化 HY-K0207 每次结合使用 100 μL 磁珠 IP/Co-IP/ChIP/细胞分选/蛋白纯化/核酸杂交 ■ MCE 多功能磁力架——磁珠完美搭档 MCE 磁力架产品是磁珠专用配套设备,支持 MCE 全线磁珠类产品
蛋白 A/G 磁珠为 IP、Co-IP 和 ChIP 实验提供了一种快速便捷的方法。 612.用0. 5% PBS-Triton X-100洗涤蛋白A/G磁珠四次。 然后加入制备的蛋白质上清液,并将与磁珠缀合的抗体和蛋白质在翻转混合器上于4°C温育2小时。 将抗SHP 1(1:100)或抗Flag(1:100)与蛋白A/G磁珠在4 ℃下预混合2 h。 4、生酮饮食通过赖氨酸β-羟丁酰化重塑癌症代谢Nat Metab. 2024 Aug;6(8):1505-1528.蛋白A/G磁珠(50 μL; 2 h)。
一、 illumina磁珠芯片制造原理 芯片由玻璃基片和微珠组成,光蚀刻出许多微米级小孔,用于容纳微珠。每个微珠表面偶联一种序列的DNA片段(一个珠子上片段序列相同),每个微珠上有几十万个片段。 lumi包 包括「方差固定变换 (variance-stabilizing transformation,VST) 算法」,该算法利用每个 Illumina 芯片上可用的技术性重复(同一序列对应约30个磁珠 1 介绍 illumina磁珠芯片有约30个随机定位的「重复磁珠」(具有同样的探针序列)。与其他类型的芯片相比,这种额外的设计可产生更高的置信度和更稳健的估计。 lumi包提供专门为illumina磁珠芯片设计的算法,并且使用现有的算法和基因注释的框架。 三、 以GSE67936为例的原始数据处理 可以看到是illumina磁珠的表达量芯片,一共有168个样品。
单位:磁珠的单位是欧姆(ohm),简称欧,符号是Ω。磁珠常用字母L表示,电路符号与电感一样作用:磁珠对高频信号才有较大阻碍作用,一般规格有100欧/100mMHZ,它在低频时电阻比电感小得多。 磁珠是用来吸收超高频信号,像一些RF电路,PLL,振荡电路,含超高频存储器电路(DDRSDRAM,RAMBUS等)都需要在电源输入部分加磁珠。 例:以下两种磁珠适合在什么电路上使用?从GZ系列的磁珠阻抗频率曲线可以看出,GZ系列的磁珠的阻抗在相对较低的频段就开始增加,因此可抑制的噪声频段范围较宽。 很多高速系统时钟频率都很高,信号线上都有可能会耦合了高频噪声信号,因此需要在信号线上增加一个磁珠来把高频噪声滤除。磁珠和电感的区别:电感是储能元件,而磁珠是能量转换(消耗)器件。 电感的单位是H,而磁珠的单位是Ω。因为磁珠的单位是按照它在某一频率产生的阻抗来标称的,而阻抗的单位是欧姆。
电感和磁珠外形接近,功能相似,很多人认为其都是“隔交通直”,以至于很多人将二者混淆。实际上,不管是原理还是应用,电感和磁珠都有不小的区别。 3、磁珠的阻抗是电抗X和电阻R的共同作用结果,低频时X主导、高频时R主导,电感多用于低频段(50Mhz),而磁珠多用于高频滤波场景,R将会吸收噪声并转化为热,因此磁珠单位是欧姆。 4、电感的滤波原理是把电能转化为磁能,再把磁能重新转化为电能(噪声)或者辐射(EMI),而磁珠是将电能转化为热能,磁珠是更“干净”的滤波元件。 磁珠主要工作在电阻大于电抗的频段,电阻占主要成分,因此磁珠的单位是欧姆。 由于电抗成分少,储能很少,所以我们说磁珠主要是通过电阻发热消耗能量的。 在选择磁珠时,我们要把目标放在高频段,仔细根据磁珠的阻抗频率曲线和目标噪声进行磁磁珠的选取。
免疫共沉淀 (Co-Inmunoprecipitation, Co-IP) 是一种利用目标蛋白特异性抗体与蛋白 A/G 磁珠或琼脂糖珠结合,从而沉淀目标蛋白及其相互作用蛋白的技术 [1-4]。 02固相介质准备将含有保护液的蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 琼脂糖混匀取出,用平衡液清洗磁珠/琼脂糖凝胶。 03预清洗 (可选)将细胞裂解液或已预处理的样本用蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 琼脂糖进行预清洗,去除非特异性结合的蛋白质。 小贴士:内源性 Co-IP 实验可选择蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 琼脂糖;外源性 Co-IP 实验中蛋白携带标签 (如 Flag、HA、c-Myc、GST 等),可以选择标签抗体类磁珠/琼脂糖凝胶珠 (如 Anti-Flag 磁珠、Anti-HA 磁珠、Anti-c-Myc 磁珠、Anti-GST 磁珠等),可一定程度增强丰度,减少 IgG 干扰。
磁珠是何方神圣? 如何慧眼识“珠”? 生物磁珠一般是具有细小粒径 (μm) 的超顺磁微球。 选磁珠时,首先关注磁珠磁性 (磁吸时间)、粒径 (大小及均一度) 等。其次根据实验目的,选择合适的表面活性基团以及由此衍生的偶联方式、蛋白结合量等。 注 2:确保目的蛋白在抗原样品中有较高水平表达。■ Step 2——样本结合通过此步骤,您将获得磁珠—抗体—抗原样品复合物。磁珠、抗体、抗原样品的加样顺序对靶蛋白得率有一定影响。 (直接将磁珠、抗体、抗原样品混合到一起,速度最快,但获得的靶蛋白纯度和得率会很低;间接结合靶蛋白得率最高,但在洗脱步骤时,抗体会和靶蛋白一起被洗脱;直接结合,蛋白得率也较高,且可通过交联固定抗体,达到单独洗脱靶蛋白的目的
,以防止在瞬时过电压作用下两者之间发生击穿; (4)线圈应尽可能绕制单层,这样做可减小线圈的寄生电容,增强线圈对瞬时过电压的而授能力。 铁氧体磁环或磁珠专用于抑制信号线、电源线上的高频干扰和尖峰干扰,它也具有吸收静电放电脉冲干扰的能力。使用片式磁珠还是片式电感主要还在于实际应用场合。 在谐振电路中需要使用片式电感。 而需要消除不需要的EMI噪声时,使用片式磁珠是最佳的选择。 片式磁珠和片式电感的应用场合 ? 磁珠的单位是欧姆,因为磁珠的单位是按照它在某一频率产生的阻抗来标称的,阻抗的单位也是欧姆。 针对我们所要滤波的频段需要选取磁珠阻抗越大越好,通常情况下选取600欧姆阻抗以上的。 另外选择磁珠时需要注意磁珠的通流量,一般需要降额80%处理,用在电源电路时要考虑直流阻抗对压降影响。
MCE链霉亲和素磁珠在涉及多种应用的 64 篇文献中被引用 (累计影响因子 360+),如免疫沉淀 (IP)、染色质免疫共沉淀 (CHIP)、RNA pull down、蛋白纯化等。 RNA 亲和分离(RNA affinity isolation),进一步证实了 SQSTM1 mRNA (已生物素化处理) 与YTHDC1 蛋白相互作用 (图 4)。 Tips:如何从链霉亲和素磁珠上解离生物素分子?链霉亲和素-生物素相互作用是已知最强的蛋白与其他分子间非共价的生物相互作用。许多应用不需要从链霉亲和素磁珠上解离生物素分子,如上述的 3 个案例。 下述为 2 种方法举例:1)解离生物素化核酸:为了从链霉亲和素磁珠上分离生物素化核酸,在 pH 8.2 的 95% 甲酰胺+ 10 mM EDTA 中孵育磁珠,65°C 孵育 5 分钟或 90°C 孵育 使用磁力架将磁珠吸到试管壁上,将含有生物素化核酸的上清液从试管中取出。2)解离生物素化蛋白质:对于生物素化蛋白质,则可在 0.1% SDS 或 SDS-PAGE 缓冲液中煮沸磁珠 3 分钟。
TE buffer)来溶解DNA并防止其降解,此外也可以在破胞前加入去垢剂来去除杂质并破坏细胞(如SDS是一种表面活性剂,能破坏细胞膜上的脂质,并在低温下使其沉淀); ②去除杂质,例如细胞碎片、蛋白质、 RNA、腐殖酸等,常用的方法有化学法(加入抑制因子沉淀杂质、使用氯仿等有机溶剂溶解杂质)、酶解法(例如蛋白酶K、RNA酶降解蛋白质、RNA); ③回收DNA,将混合体系中的DNA进行回收,主要方法有醇沉淀法 (DNA不溶解于异丙醇、乙醇等)、过柱收集法(DNA在高盐环境下可以吸附在硅胶滤膜上,这是大部分试剂盒采用的方法)、磁珠吸附法(DNA分子通过氢键吸附到具有磁性的磁珠上,然后在磁场中分离磁珠,常见于自动提取仪 ); ④清洗溶解DNA,对沉淀的DNA、收集柱DNA以及磁珠吸附的DNA使用70%乙醇清洗,最后待乙醇挥发后使用无菌水溶解DNA。 尤其是对于环境样本,需要更多预处理来去除杂质,但总的来说,DNA提取总则如下: a.保证核酸一级结构的完整性; b.核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子; c.其他生物大分子如蛋白质
-蛋白相互作用的经典方法。 ChEC技术需要在待研究的目的蛋白C端加上MNase构成融合蛋白重组体。 其原理与CUT&RUN类似,首先通过刀豆蛋白A包被的磁珠(ConA beads)吸附细胞(与细胞膜上的糖蛋白结合),通过洋地黄皂苷在细胞膜上“打孔”,在抗体引导下,转座酶精准靶向目的蛋白。 2021年4月,美国华盛顿大学Anoop P. 图4.CUT&Tag在单细胞上的应用 (上图(Wu et al., 2021);下图(Bartosovic et al., 2021))。
对于问题编码,我们使用: 配置量子位:用于描述配置和不同磁珠相对位置的量子位 相互作用量子比特:编码不同氨基酸之间相互作用的量子比特 对于我们的实验案例,我们使用如下图所示的立方晶体结构,通过配置量子位对蛋白质折叠进行编码 (3) Punishment:用于惩罚最近邻接触内,磁珠之间的局部重叠的惩罚参数。 2.5 肽定义 多个氨基酸脱水缩合形成的化学键叫肽。基于主链和可能存在的侧链,我们定义了肽对象。 系数Hy是肽珠间的一种相互作用,这些作用是通过强制执行蛋白质肽对象的惩罚参数来对蛋白质折叠进行约束,相互相互作用的大小是通过调用蛋白质折叠的化学函数来执行得到的,此处我们只要设定好惩罚参数就可以得到不同的系数 3.2 对哈密顿量求解 我们用CVaR-VQE对每一个肽珠间的哈密顿量进行求解,得到哈密顿量的值(肽珠序列一开始时被设定为WHLGEL)。 最后让我们来看一下CVaR-VQE梯度下降的效果: 在20次迭代后目标函数逐渐收敛,说明我们可以利用这一方法来解决蛋白质折叠这一难题,并且速度更快。 4.
Concanamycin A (Con A,Folimycin,刀豆素A,AbMole,M7737) 是一种大环内酯类化合物,作为V-ATP酶(液泡型ATP酶)的特异性抑制剂,在基础研究中被广泛应用。 在前列腺癌细胞(LNCaP、22Rv1)中,Concanamycin A(刀豆素A,10 nM)联合其他抑制剂(如Enzalutamide )可协同降低雄激素受体(AR)信号通路的活性[1]。 Concanamycin A(Con A,Folimycin,刀豆素A,AbMole,M7737) 在大鼠模型中,静脉注射(剂量为1 mg/kg)可用于研究V-ATP酶对CD36蛋白亚细胞循环的调控,并揭示其在心肌脂质代谢紊乱中的作用 AbMole的Protein Synthesis IN-1 (AbMole, M4879) 、MG132 (AbMole, M1902) , Concanamycin A (Con A,Folimycin,刀豆素 Protein Synthesis IN-1作为蛋白质合成抑制剂,用于追踪FREE1蛋白的半衰期和降解过程。
等细胞分别落入微孔后,再在蜂窝板上铺上微磁珠。最终在微孔中也会形成“磁珠-细胞-反应试剂”的体系,完成单个细胞的相关反应(例如转录组测序的细胞裂解、转录组、扩增等过程)。 Gel bea 由凝胶珠和磁珠上的一段引物构成,引物序列构成依次为:全长Illumina TruSeq Read 1 测序引物、16nt 10X Barcode 序列(每个 Gel bead 的 10X 步骤 1:准备好 10X 官方提供的微磁珠。这些磁珠上都连接着后续反转录所需的接头、barcode、UMI 等序列。 10x genomics 单细胞文库构建 步骤 2:磁珠进入 10X genomics 芯片。磁珠在可以管道中流动(这里管道中是水),会经过两个“十字路口”。 由于磁珠是亲水的,所以一个个磁珠以及其吸附的细胞就就被包裹在水滴里。 步骤 3:在这些油包裹的水滴里,将完成细胞裂解、反转录、扩增等步骤。
我们《生信技能树》早期也分享过蛋白质组学数据处理教程,目录如下: 蛋白质组学第1期-认识基础概念 蛋白质组学第2期-认识蛋白质组学原始数据 蛋白质组学第3期-蛋白质组学的三大元素 蛋白质组学第4期 文章搜库过程复现 **丙酮沉淀 Acetone precipitation **: 蛋白质在酸性或者疏水条件下会发生变性,使蛋白浓缩,可以去除污染物。 蛋白纯化 Depletion: 去除白蛋白ALB和免疫球蛋白。 免疫沉淀 IP: 针对特定靶蛋白的抗体与样品(细胞裂解物等)中的靶蛋白形成免疫复合物,随后利用Protein A-磁珠或Protein G-磁珠将该免疫复合物从混合物中沉淀下来。 蛋白变性 Denaturation:防止目标蛋白被蛋白酶酶解。 还原 Reduction:酶解前处理一般需要还原蛋白中的二硫键,破坏蛋白结构来加强酶解的效率。 酶解 Digestion:用蛋白水解酶(最常见的是胰蛋白酶)消化成多肽。消化可以在凝胶中、溶液中、膜上、纳米珠上或通过PCT辅助的方式进行。