Sci. Adv. | CryptoBank：面向隐秘结合位点的大规模数据库与序列预测模型

来源： Pedro Febrer Martinez et al., CryptoBank: A resource for the identification and prediction of cryptic sites in proteins.Sci. Adv.12,eady6364 (2026). 发表时间： 2026年4月22日 通讯作者： Francesco L. Gervasio（日内瓦大学 / 伦敦大学学院） 数据资源：www.cryptobankdb.com 代码链接：https://github.com/Gervasiolab/CryptoBank

一、研究背景与问题提出

1.1 "不可成药"蛋白的困境

传统药物发现高度依赖蛋白质表面明确的结合口袋——酶活性位点、离子通道孔道、已知变构位点等。然而，大量与疾病密切相关的蛋白质（如 RAS、MYC 等转录因子和信号蛋白）在其天然未结合（apo）状态下表面平坦、缺乏明显的空腔，被归类为"不可成药"靶点，极大限制了小分子药物的设计空间。

1.2 隐秘口袋（Cryptic Pocket）的概念

近年研究打破了这一认知范式。所谓隐秘口袋，是指在蛋白质自由态（apo 态）中不存在或不可探测，但在配体诱导或蛋白质自发构象波动后显现的结合空腔。其物理本质是：

• • 隐秘口袋对应蛋白质构象集合（conformational ensemble）中的高能态构象；
• • 这类构象在没有配体时出现概率极低，却可被小分子捕获并稳定；
• • 因此，隐秘口袋兼具直接抑制和变构调节两种药理学潜力。

1.3 现有方法的局限

此前用于发现隐秘口袋的方法主要分两类：

核心瓶颈： 缺乏一个大规模、经过集合平均验证的隐秘口袋基准数据集，制约了预测模型的训练与评估。

二、CryptoBank 数据库的构建

2.1 数据收集与过滤流程

研究团队从 RCSB PDB（截至2025年8月11日）出发，实施了严格的多层筛选策略：

236,889 个 PDB 条目（X射线晶体学 + 冷冻电镜，分辨率 ≤ 2.5 Å）
        ↓ 过滤（含 UniProt 编号 + 95% 序列同一性簇归属）
    157,327 个有效 PDB 条目
        ↓ 拆分为单链，分配至 apo / holo 集合
  145,581 apo 链 + 168,916 holo 链
        ↓ 配对（同一95%同一性簇内）+ 纳入 AlphaFold 模型
   81,302 apo 链 + 163,499 holo 链 → 19,781 个同一性簇
        ↓ 配体聚类（完全连接算法，7 Å 质心距离阈值）
   34,014 个唯一配体 + 56,279 个唯一结合位点
        ↓ 结构比对（Cα RMSD ≤ 2.5 Å）+ 评分
    6,000,000 个唯一 apo-holo-配体组合

关键设计决策：

• • 将 AlphaFold 预测结构作为额外的 apo 链纳入，弥补了缺乏实验 apo 结构的蛋白质的覆盖空白；
• • 使用 Tanimoto 相似性为配体分配唯一标识符，确保相同化学实体跨链共享同一 ID；
• • 同一 holo 链中的每个配体单独处理，实现位点级别的精细分析。

2.2 隐秘性评分函数（Crypticity Scoring Function）

评分函数的设计思想来源于一个物理直觉：若某结合位点是隐秘的，将配体叠加到 apo 结构时，配体原子将与 apo 态的残基产生严重的空间碰撞（clash）；而在 holo 态中则几乎无碰撞。

具体地，对于每个 apo-holo-配体组合，模型执行以下计算：

第一步：壳层势能计算

将距离矩阵 （配体原子与蛋白原子间的成对距离，4 Å 截止）划分为 个同心球壳 ，每个壳层的势能为：

𝟙

其中 为可学习参数，𝟙 为指示函数。

第二步：系统能量聚合

第三步：配体分段与最终概率

为提升对结合区域不同部分的空间分辨率，将配体划分为 个片段，每段独立计算能量 ，最终以 sigmoid 函数聚合：

模型训练细节：

• • 训练集：199 个人工标注的 apo-holo 对（71 个隐秘，128 个非隐秘）
• • 正则化：L1 正则化抑制过拟合；5折交叉验证
• • 超参数搜索：（配体分段数），（壳层数），（正则化强度）
• • 最终准确率：89%（独立测试集）
• • 判定阈值：评分 ≥ 0.5 即判定为隐秘构象

2.3 集合层面的位点隐秘性评分

为克服单一 apo 结构的局限性（不同晶体学条件可产生不同的 apo 构象），研究团队对同一结合位点的所有 apo-holo-配体组合取平均评分，作为位点级别的集合隐秘性评分（site crypticity score）。

此外，采用异常值导向策略（outlier-oriented strategy）：对均值评分低于0.5、但存在少量高隐秘性异常构象的位点进行回收，避免遗漏"稀有但真实"的隐秘位点。

三、数据库统计特征与药化学分析

3.1 总体规模

3.2 配体分子量与埋藏程度分类

研究根据两个维度对隐秘位点进行分类：

• • 配体大小：片段类（ Da）vs 配体类（ Da）
• • 位点埋藏深度：埋藏型（相对溶剂可及面积 RSA < 0.3）vs 表浅型（RSA > 0.3）

值得注意： 约 77% 的配体类隐秘位点所结合配体分子量在300–500 Da，符合 Lipinski 类药五原则（rule-of-five），提示这些位点具有直接的临床转化潜力。

3.3 配体化学空间分析与片段库设计

研究团队对9,400个仅出现在隐秘位点的配体进行了系统的化学空间分析：

• • 利用 Morgan 指纹相似性 + UMAP 降维 + HDBSCAN 聚类，识别出 60个结构多样性簇
• • 簇间最大 Tanimoto 相似性仅为 0.35，表明化学多样性极高
• • 这60个代表性分子可作为针对隐秘口袋的专属片段库的设计起点

此外，利用"相似蛋白倾向结合相似配体"的原则，CryptoBank 支持靶标特异性片段库的定制化生成，并可以配体隐秘性评分对筛选候选分子进行排序。

四、与药学相关靶点的交叉分析

4.1 与 Open Targets 平台的交叉

将 CryptoBank 与 Open Targets 数据库（疾病关联评分 > 0.5）交叉后：

• • 约6,000个疾病相关基因中，有 1,567 个独立簇在 CryptoBank 中有对应
• • 其中 33.8% 的疾病相关蛋白含有隐秘位点
• • 在已有上市药物或在研药物（仅考虑小分子/PROTAC类）的133个单结合位点靶蛋白中，26.3% 的结合位点具有隐秘性

4.2 典型案例

MALT-1（黏膜相关淋巴组织淋巴瘤转位蛋白1）

• • CryptoBank 识别出其 caspase 结构域中的一个变构隐秘口袋
• • 该位点当前正处于 1期临床试验（NCT05544019），用于治疗复发/难治性 B 细胞肿瘤
• • 验证了 CryptoBank 捕捉具有临床意义的隐秘位点的能力

GLP1R（胰高血糖素样肽-1受体）

• • apo/holo 结构比对清晰显示：配体结合诱导α螺旋部分解折、环区位移及另一α螺旋的内移，形成隐秘口袋
• • 与当前主流 GLP-1 类药物（如司美格鲁肽）的靶点高度相关，提供新的变构调节视角

4.3 "不可成药"蛋白的重新评估

在 Open Targets 数据库标记为"不可成药家族"的蛋白中（筛选条件：RSA < 0.3 且结合25–50个重原子的配体）：

• • 30.3% 含有埋藏且可配体化的结合位点
• • 其中 9% 的蛋白含有潜在可成药的隐秘口袋

这一结果直接支持了"隐秘口袋可系统性扩展可成药蛋白质组"的核心论点。

五、蛋白质语言模型（PLM）微调与隐秘位点预测

5.1 模型选择与微调策略

研究团队选用 ProtTrans Prot-T5-XL-UniRef50 作为基础模型：

• • 预训练于4,500万条蛋白质序列（140亿氨基酸）
• • 采用**低秩自适应（LoRA）**向注意力机制注入可训练参数，实现参数高效微调
• • 在输出端添加卷积神经网络预测头（1D卷积层，512个输出通道，核尺寸3 → 线性分类层）
• • 任务定义：残基级二分类（每个残基是否属于隐秘结合位点）

5.2 训练数据集构建

数据集切分策略（防止序列同一性泄漏）：

• • 使用 MMseqs2 以20%序列同一性进行聚类（--min-seq-id 0.2, --cluster-mode 3）
• • 按连通分量（connected component）整体分配至同一数据集，确保测试集中任意序列与训练/验证集的相似性 < 20%

• • 正类（隐秘残基）占比仅约 5%，属于高度不平衡分类任务

5.3 模型性能评估

关于 PR AUC 的说明： 由于正类比例极低（约5%），ROC AUC 在不平衡场景下容易高估模型性能，而 PR AUC 是更严格、更真实的性能衡量指标。测试集 PR AUC 为0.11，较随机预测（~0.05）提升超过两倍，表明模型对未知序列仍有一定泛化能力。

适用性边界总结：

查询序列与 CryptoBank 同一性 > 20%  →  ROC AUC ≈ 0.92，PR AUC ≈ 0.65（高置信预测）
查询序列与 CryptoBank 同一性 < 20%  →  ROC AUC ≈ 0.70，PR AUC ≈ 0.11（初步筛查）

六、PLM 预测与分子动力学模拟验证

研究团队选取四个不在训练集中的蛋白质进行预测验证，所用 MD 框架：GROMACS 2023 + PLUMED 2.9，分子力场 DES-Amber 或 AMBER99-ILDN，水模型 TIP4P-D 或 TIP3P；增强采样采用 SWISH-X 方法（6个并行副本，含1M苯作为余溶剂，OPES 多温度组件，温度范围300–350 K）。

6.1 HyBcl-2-4（水螅 Bcl-2 同源蛋白）

• • 与人类 Bcl-XL 序列同一性 37.5%，整体折叠保守（RMSD < 2 Å）
• • PLM 预测在 HyBcl-2-4 与 HyBak1 BH3 的结合界面存在隐秘口袋
• • 人类 Bcl-XL 在该界面的隐秘口袋已有晶体学验证；HyBcl-2-4 此前无相关报道
• • SWISH-X 证实口袋开放；无偏 MD 未能发现，与人类同源蛋白的已知行为一致

6.2 TPP1（端粒蛋白）

• • 参与端粒酶招募与激活，是重要的治疗靶点
• • PLM 预测在远离蛋白-蛋白相互作用界面的区域（α螺旋及其连接环）存在变构隐秘位点
• • 冷冻电镜结构（PDB: 7TRE）显示蛋白核心内部存在深埋空腔，但如何变为溶剂可及不明
• • 无偏 MD 中预测区域形成溶剂暴露腔；SWISH-X 进一步证明该区域的α螺旋倾斜和连接环外移可将深埋空腔与蛋白表面相连通，形成完整的通路

6.3 VWF A3 结构域（血管性血友病因子 A3 结构域）

• • 介导血小板黏附（通过与胶原I/III结合）
• • PLM 识别出7个高隐秘性评分残基（>0.6），位于胶原结合面的对侧，夹持在两个α螺旋与β折叠之间
• • 4个已报道的高分辨率晶体结构中该区域均无明显口袋
• • 一个抗体结合结构（PDB 中含乙酸分子的结构）在预测区域内存在微小空腔——与预测吻合
• • SWISH-X 模拟显示 C 端6残基的α螺旋发生位移，口袋体积显著增大

6.4 ROR2 CRD（受体酪氨酸激酶 ROR2 的半胱氨酸富集结构域）

• • PLM 预测15个残基（归一化评分 > 0.6）分布于3个α螺旋及1个连接环
• • 该区域在其他受体家族（Frizzled 类、NRK CRD）中介导脂质/辅因子结合，但 ROR2 的晶体结构（PDB: 9FSE）未报告类似特征
• • SWISH-X 模拟揭示：三螺旋间可形成沟槽样特征，空间足以容纳脂质配体；提示一种与 Frizzled 类受体类似的配体识别机制

七、局限性与未来展望

7.1 当前局限

7.2 未来方向

• • 将结构信息整合进预测模型，突破序列相似性壁垒
• • 扩展至冷冻电子断层扫描等新兴结构数据源，提升构象多样性覆盖
• • 与实验片段筛选形成闭环，持续丰富数据库
• • 开发针对隐秘口袋的从头配体设计（de novo design）工作流程