【免疫学实验】放射免疫法、酶联免疫吸附法和竞争抑制分析

放射免疫法（RIA）和酶联免疫吸附法（ELISA）是利用抗体和抗原直接结合的检测方法，两者原理相同，但其检测的方式不同。放射免疫分析常用于测量血液和组织液中的激素水平，而酶联免疫吸附法常用于病毒诊断，如检测人类免疫缺陷病毒（HIV）引发的艾滋病。在这两种方法中，我们都需要一种已知抗原或抗体的纯制剂（或者两者都需要），以便制定标准曲线。根据标准曲线我们可以分析样品中特定抗原的量，如患者血清中的HIV p24 蛋白的量。因此，需要获得纯化的抗原特异性抗体。另外，还可以使用RIA 或ELISA 来对混合物（如血清）中的特异性抗体进行定量，在这种情况下，首先需要获得纯化的抗原。

用RIA 测定抗原浓度时，所用的抗原特异性抗体是同位素标记的（常用125I）。在ELISA 中，则将一个酶化学连接到抗体上进行标记。在应用两种方法时，首先将未被标记的成分（即含有未知量抗原的溶液）附着于固相载体（多孔塑料板）上，再将标记的抗体添加到小孔中与附着在固相载体上的抗原结合，然后洗脱未结合的抗体和其他蛋白质。在RIA 法中，抗体结合量直接根据被包被孔中所保留的放射性量进行测量，而在ELISA 中，标记在抗体上的酶可以将底物转化为不同颜色的反应产物（图1），通过读取酶标反应板中的颜色变化直接定量产物的浓度。ELISA 的优点是便于数据采集，同时避免了放射性物质的危害。这些优点使得ELISA 成为许多分析抗原- 抗体直接结合时的首选。这类检测的另外一种方法是以标记的抗免疫球蛋白抗体作为RIA 或ELISA 的二抗，将未标记的抗体与未标记的抗原涂层板结合，因为每个未标记的抗体上能够结合两个分子以上标记的抗免疫球蛋白抗体，所以使用这种二抗放大了信号。当用于检测溶液中抗体浓度时，RIA 和ELISA 也可以反向进行，在这种情况下，将未标记的抗体包被附到板上，添加标记的抗原，并测量洗涤后标记抗原的结合量。

图1 酶联免疫吸附法（ELISA）的原理：为了检测抗原A，纯化的抗原A特异性抗体与酶发生化学反应。将待测样品涂布于塑料孔表面，非特异性结合；塑料上残留的黏性位点被添加的无关蛋白（未显示）封闭。然后，在防止非特异性结合的条件下，将标记抗体添加到孔中，这样只有与抗原A结合才能使标记抗体保留在表面。将未结合的标记抗体从所有孔中去除，并通过酶依赖的变色反应检测所结合的抗体。这种检测方法允许在多通道光谱仪中读取微孔板，大大加快了检测速度。在此基本方法基础上的改进版可检测未知样本中的抗体或抗

捕获酶联免疫吸附法（capture ELISA）或夹心酶联免疫吸附法（sandwich ELISA）是ELISA 的一种改良方法，常被用于检测细胞因子等分泌性产物。在这种方法中，固定在塑料板上的抗原特异性抗体能够以高亲和力结合抗原，并将其固着在板的表面，因此初始混合物中的低浓度抗原也能被结合。随后再使用与固定抗体识别的表位不同的标记抗体来定量已结合的抗原。

多因子检测法是可以在单个实验中同时定量多个抗原的技术，通常用于检测临床血清样本或实验动物血清中的多个细胞因子的水平。采用不同荧光染料（有多达100 种可供使用）差异标记小微球，荧光染料可根据其独特的发射光谱进行区分。将特定标记的微球与某种抗原（如某种细胞因子）的抗体连接，添加微球到检测样品中以捕获抗原，再用另一种荧光染料标记的抗体（该抗体识别不同的抗原表位）检测结合抗原，用Luminex® 分析仪定量各种不同标记的微球的荧光强度（结合抗原量）。

这些检测方法阐明了血清学分析的两个关键方面。首先，至少有一种试剂必须以纯的、可检测的形式提供。其次，必须能将标记的结合部分与未结合的游离部分分离，从而确定特异性结合的百分比。通常情况下采用将未标记的伴侣捕获在固体载体上的方法。如图1所示，将未标记的抗原附着到孔内，用以捕获标记的抗体，再去除未结合的标记抗体。这些利用抗体检测的方法的关键是从游离部分获得结合的分子。

由于依赖于纯化的标记的抗原或抗体，RIA 和ELISA 不能直接测量未知成分样本中抗原或抗体的含量。竞争性抑制法解决了这个问题，如图2 所示。其原理是利用未知样本中特定抗原与一个标记的参考抗原竞争结合塑料板上附着的抗体，从而检测特定抗原的含量。方法如下：首先通过添加各种已知的、未标记的标准制剂的量来构建标准曲线；再通过与标准品的比较，就可以测定未知样品中抗原的含量。竞争性结合试验也可用于定量未知成分样品中的抗体，方法是将适当的抗原附着在平板上来定量待测样品抑制已标记特异性抗体结合的能力。

图2 未知样品中抗原的竞争抑制分析：将未标记抗体固着于一组孔内，并将标记的抗原标准制剂与之结合。然后将未标记的标准品或试验样品以不同剂量加入，测量标记的抗原被标准品取代的量，生成特征性的抑制曲线。将已知剂量的未标记抗原标准品生成的标准曲线与未标记的试验样品产生的曲线进行比较，即可计算出未知样本中的抗原量。图中的绿线表示不与抗A抗体反应的样品。