空间转录组学习笔记-第8周（空转分辨率讨论）

生信菜鸟团

发布于 2025-07-08 17:37:13

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基于测序的空间转录组技术（sequencing-based ST，sST）正以前所未有的速度突破分辨率极限，大步迈入微观领域。

自 2016 年首个基于微阵列芯片（分辨率约 200 μm）的功能原型诞生以来，sST 通过多种创新策略实现了分辨率跨越式的提升。在过去近十年中，sST 平台遵循着中心距每年减半的趋势，分辨率提高了超过 1000 倍，突显了 ST 技术的快速发展步伐。

提高分辨率的一种直接方法是制造具有更精细特征的微阵列。这些技术利用预先分配并与已知空间坐标匹配的确定性条形码 (deterministic barcoding)，其中最近的 Visium HD Spatial Gene Expression 结合了改进的微阵列制造技术，在 2 μm 分辨率下实现了高质量的 sST 。

区别于确定性条形码，另一种基于微珠的方法也被开发出来以应对分辨率挑战，包括 Slide-seq、HDST 等。其中，Slide-Seq 和 HDST 的初始实现与其他 sST 方法相比 RNA 捕获效率较低，然而，Slide-Seq 的后续改进（Slide-SeqV2）使其能够作为 Curio Seeker 商业化。

第三种方法，即利用 NGS 进行 sST，迄今为止在生成微观尺度的高分辨率数据方面最为成功。使用高分辨率（0.5–0.7 μm）的 DNA 纳米球（DNB）阵列，Stereo-Seq 能够进行单细胞水平的分析。利用 illumina 测序仪器，Seq-Scope 实现了亚微米分辨率（0.5–0.6 μm），可支持在单细胞甚至亚细胞水平的分析。Stereo-Seq 现已由华大基因作为 STOmics 商业化，而 Seq-Scope 促进了衍生技术如 Open-ST 和 Nova-ST 的开发。通过分析连续切片并沿 Z 轴重建，其中一些技术已被用于 3D 分析。

所有上述方法都旨在提高阵列密度以最小化像素间距。最近组织膨胀（tissue expansion）作为一种新的策略，它从物理上放大了组织本身，且不影响转录组捕获效率。最近，在 Seq-Scope-X 中，组织膨胀与高分辨率 Seq-Scope 阵列相结合，实现了纳米级分辨率（180 nm），支持在组织范围内进行亚细胞分析。

sST技术的分辨率提升。纵轴为分辨率，横轴为年份。蓝色点表示基于确定性条形码的方法，绿色点表示基于微珠的方法，黄色表示基于NGS的方法。红色空心圆圈表示已商业化，红色圆心表示使用组织膨胀技术。可以看到，Seq-Scope-X 的分辨率已达到大多数基于成像的空间转录组技术（image-based ST，iST）的水平。

本次稍微重点了解一下基于NGS原理的 Seq-Scope 以及由它衍生的 Open-ST（Nova-ST 感觉上和 Open-ST 非常类似）。

一、Seq-Scope原理

图A：Seq-Scope的1st-Seq文库结构。P5/P7：Illumina 测序接头，用于流动槽表面扩增。TR1 (TruSeq Read 1)：测序引物结合位点。HDMI：20-32 nt 随机条形码（空间坐标标识）。HR1 (HDMI Read 1)：HDMI 测序引物位点。Oligo-dT：用于捕获 mRNA 的 polyA 尾（初始被封闭）。DraI：限制性内切酶位点（用于后续释放 oligo-dT）。

图B：固相扩增生成HDMI簇。文库在涂有 P5/P7 引物的流动槽表面进行桥式 PCR，形成数千个相同寡核苷酸拷贝的“簇”。每个簇代表一个空间像素点，包含唯一 HDMI 序列。

图C：1st-Seq第一次测序。通过边合成边测序（SBS）读取 HDMI 序列，记录每个簇的物理坐标（X，Y）与 HDMI 序列。

图D：用 DraI 酶使得 oligo-dT 暴露，NaOH 清洗去除游离片段，形成 HDMI 阵列。

图E：冰冻组织切片贴附于 HDMI 阵列，释放 mRNA。

图F：oligo-dT 捕获 mRNA，合成 cDNA 第一条链。

图G：随机引物延伸合成 cDNA 第二条链（含 UMI 序列，用于去重复）。

图H：PCR 添加测序接头，构建含 P5/P7 的完整文库。

图I：2nd-Seq文库结构。

图J：阵列密度。每 100 μm² 含 150 个 HDMI 簇，支持单细胞级分辨率。

二、Open-ST

图A：所有实验协议与计算工具开源，提供可复现的端到端方案，降低技术门槛。

图B：基本原理和Seq-Scope一致。创新点：使用图案化芯片（Patterned Flow Cell），表面有规则排列的纳米孔（中心间距约 0.6 μm），用于固定寡核苷酸。比 Seq-Scope 能产生更密集、更规则排列的捕获点。并且规则排列降低了单个点内混合不同条形码信号的概率，提高了空间定位的准确性。

图C：Open-ST 设计了可 3D 打印的切割引导装置。优势：可以将一个昂贵的 NovaSeq S4 测序芯片高效、精确且无损伤地切割成~360 个小的、独立使用的捕获区域（ 3x4 mm），每个捕获区域的成本约 €35。用户可以根据实验需求选择合适大小的捕获区域，无需为每次实验浪费整个芯片，极大地降低了实验门槛。

图D：组织处理与数据生成。将冷冻切片放置在捕获区域上，对同一切片进行优化的 H&E 染色和高分辨率成像，进行 mRNA 原位捕获。Open-ST 优化了实验流程，提高了实验成功率，可以从同一切片上获取高质量的 H&E 图像和转录组数据。

图E：2D 数据整合与分析。使用 openst 软件包将组织形态信息与单张切片的 ST 数据整合，包括自动细胞分割、模态的成对对齐、在分割细胞中量化转录本。

图F：3D 重建与可视化。使用 STIM 对连续切片的 H&E 染色和基因表达数据进行对齐，对齐后的成像和转录组数据可以作为一个3D 虚拟组织块，使用任何 3D 渲染引擎（如 ParaView）进行可视化和交互式查询。

三、数据分析挑战

基于NGS平台实现的高分辨率sST技术在带来亚微米级精度的同时，也引入了独特且严峻的计算分析挑战：

极端稀疏性与海量规模： 亚微米级别的“像素”（Pixel）是基本分析单元，一个典型组织切片包含数百万至数十亿个像素。然而，每个像素捕获到的转录本数量（UMIs）通常极其稀少（可能仅个位数），远低于传统“斑点”（Spot）成百上千的丰度。这种“极端稀疏性”使得传统的基于丰富信息的分析方法失效，并带来了巨大的数据存储、访问和处理负担。
细胞分割困境： 为了应用成熟的单细胞分析工具，通常需要将转录本数据聚合到单细胞水平。然而，基于组织学图像（如H&E, DAPI）的细胞分割（Cell Segmentation）在复杂组织（如细胞密集区、不规则形状细胞、多核/无核细胞、2D切片未切到核的细胞）中极其困难且容易出错。这些分割错误会显著影响下游的差异表达分析、细胞互作分析等结果的可靠性。虽然存在不依赖组织学的转录本驱动分割方法（如Baysor, Proseg），但面对sST全转录组、高噪声、大数据量的特点，其应用仍具挑战。
数据碎片化与跨平台整合难题： 不同的sST平台（甚至同一平台的不同版本）在分辨率、数据模态（是否包含组蛋白、染色质信息等）、原始数据格式和输出结构上存在显著差异。这种数据碎片化严重阻碍了跨平台数据的整合分析、比较研究以及通用分析工具的开发和共享。
高效存储与访问瓶颈： 海量且稀疏的亚微米分辨率数据（十亿级像素）对数据存储格式提出了极高要求。现有常用格式（如AnnData）在处理如此规模的原生分辨率数据时效率低下或力不从心。许多公共数据集被迫以粗粒度网格（如10 x 10 μm）或分割后细胞的形式发布，损失了宝贵的原始高分辨率信息。新兴格式（如SpatialData，OME-Zarr）正在探索解决方案，但其效率和普适性仍需验证。
3D分析的特殊挑战： 虽然通过连续切片可进行 3D 重建，但 Z 轴分辨率（~10μm）远低于 XY 平面（<1μm），且高精度对齐多个亚微米分辨率的 2D 切片本身就是一个难题。现有为 2D 设计的分析方法和数据格式大多难以高效扩展到 3D。

总的来说，基于 NGS 的 sST 技术实现了革命性的空间分辨率，但其产生的数据具有“海量、稀疏、碎片化”的核心特征，对传统的细胞分割方法、数据分析流程、计算资源以及数据存储与共享标准都构成了巨大挑战。克服这些挑战需要发展免分割分析、高效稀疏数据处理算法、统一且可扩展的数据格式、以及专门针对 3D 高分辨率数据的分析框架。