三代测序100问（8）| 三代全长转录本该如何鉴定？

在上一期《三代测序100问》中，我们深入探讨了三代长读长测序如何凭借其覆盖全长mRNA的独特优势，将转录组学研究的分辨率从基因水平提升至转录本（Isoform）水平。然而，获得全长测序数据仅仅是成功的第一步。测序文库中可能混入不完整的cDNA片段、接头连接失败的序列，甚至部分降解的产物。因此，在拿到测序数据后，很多老师和同学常常会忽略一个至关重要的环节——全长转录本的鉴定。 假如直接拿着未经鉴定的数据进行后续的比对和定量，那么分析结果的可靠性将大打折扣。

那么，究竟该使用哪些软件工具，才能精准地从海量长读长序列中“沙里淘金”，识别出真正的全长转录本呢？今天，我们就跟随山东第一医科大学李冕博士的专业指引，一探究竟。

全长转录本的分子标记：引物与Poly(A)尾

李老师首先回顾了全长转录组测序的建库基础：“无论是PacBio的Iso-Seq，还是ONT的cDNA-PCR建库流程，其核心都是利用真核生物成熟mRNA特有的poly(A)尾结构进行富集。”这意味着，我们测序获得的序列，其特征是含有poly(A)尾，并且在序列两端还保留着建库过程中引入的PCR扩增引物序列。

正是这些独特的分子标记——两端的引物序列和末端的poly(A)尾——成为了我们鉴定全长转录本的关键“身份证”。通过识别并利用这些特征，我们才能有效地筛选出完整的、高质量的全长转录本序列。

PacBio平台：Lima与IsoSeq3的珠联璧合

对于PacBio平台，其全长转录本的鉴定流程通常较为自动化且高效。

• 第一步：解多重（Demultiplexing）与引物去除 “如图所示的demultiplex这一步，通常是在测序公司完成的。”李老师解释道，“在对带有不同条形码（barcodes）的样本进行拆分之后，PacBio官方的lima工具会同时识别并去除序列两端的PCR引物。经过这一步处理后，获得的序列基本上就是去除了双端引物并保留了poly(A)尾的全长转录本。”

• 第二步：精修（Refine）与嵌合体去除 尽管lima已经去除了大部分非全长序列，但为了进一步确保序列的“纯度”，特别是去除潜在的转录本嵌合体（即两个不相关转录本错误连接在一起的序列），PacBio官方提供了IsoSeq3软件套件，其中的refine命令便是执行这一任务的关键。 “如果想进一步去除序列中可能残余的poly(A)尾，以及一些在建库过程中偶发产生的转录本嵌合体，可以使用IsoSeq3的refine命令，如图中第三步所示。”李老师补充道。refine通过更严格的算法，对序列进行深度过滤和优化，确保最终产出的是高度可靠的全长转录本集合。

ONT平台：Pychopper的精准识别

对于ONT纳米孔测序平台，全长转录本的鉴定则依赖于其特定的工具：

• Pychopper：基于引物和Poly(A)识别 “ONT平台可以使用官方的pychopper工具，通过识别序列双端引物以及poly(A)尾序列来鉴定和提取全长转录本。”李老师强调道。

“这里有一个非常关键的注意事项！”李老师着重指出，“在对ONT原始数据进行质控时，务必保留其双端引物序列，否则pychopper将无法识别全长转录本。有些同学在质控阶段就把引物过滤掉了，导致后续无法进行全长鉴定。”这一点在实际操作中极易被忽视，却直接影响到全长信息的获取。

全长鉴定的意义：为后续分析奠基

“在我们获得真正意义上的全长序列后，就可以放心地进行下一步的转录本参考基因组比对和表达定量了。”李老师总结道，“这样做的好处是显而易见的：它确保了后续的所有分析都是真正基于完整的、高质量的转录本信息，而不是基于片段拼接或不完整的序列，从而极大地提升了分析结果的准确性和生物学意义。”