三代测序 - 数据质控 | LongReadSum

一、LongReadSum简介

LongReadSum 是美国费城儿童医院Kai Wang教授团队（图1）开发的一款专门针对长读长测序数据设计的快速质控工具（如纳米孔测序、PacBio测序等）。它支持多种文件格式，包括FASTA、FASTQ、BAM、POD5、FAST5和sequencing_summary.txt，能够快速生成HTML和文本格式的质控报告。无论是全基因组测序（WGS）、RNA-Seq，还是甲基化修饰的数据，LongReadSum都能轻松应对，其优点在于支持的数据格式多样。到目前为止最新版本v1.5.0更新于2025年1月23号。

图1. Kai Wang教授团队

二、安装方法

1. 使用conda或mamba安装（推荐）

首先，创建一个新的conda环境longreadsum（Python 3.9），并进行激活。

#创建conda环境
$ conda create -n longreadsum python=3.9
#激活longreadsum环境
$ conda activate longreadsum

#如果使用mamba，请将conda替换为mamba

然后，运行以下命令安装LongReadSum及其依赖软件：

$ conda install -c wglab -c conda-forge -c jannessp -c bioconda longreadsum=1.5.0

#如果使用mamba，请将conda替换为mamba

2. 使用Docker安装

确保安装Docker后，从Docker Hub拉取最新的LongReadSum镜像。

docker pull genomicslab/longreadsum

运行时，使用以下命令（注意将C:/Users/.../DataDirectory替换为你的数据目录）：

$ docker run -v C:/Users/.../DataDirectory:/mnt/ -it genomicslab/longreadsum bam -i /mnt/input.bam -o /mnt/output

三、使用教程

1. 基本用法

$ longreadsum <FILETYPE> -i $INPUT_FILE -o $OUTPUT_DIRECTORY

其中，<FILETYPE>是文件类型, $INPUT_FILE 是输入文件路径，$OUTPUT_DIRECTORY 是输出目录。例如，对于 FASTQ 文件，运行：

$ longreadsum fq -i input.fastq -o output_directory

不支持fastq.gz的压缩格式，使用起来较麻烦！

2. 常用参数

3. 全基因组测序（WGS）BAM文件 (示例）

对于全基因组测序数据，经过与参考基因组（如人类的GRCh38）比对后生成的BAM文件，LongReadSum可以生成详细的质控报告，包括读长分布、碱基质量等信息。

$ longreadsum bam -i input.bam -o output_directory

4. 带有甲基化修饰的BAM文件(示例）

如果BAM文件包含甲基化修饰信息，可以使用以下参数：

$ longreadsum bam -i input.bam -o output_directory --mod --modprob 0.8 --ref reference.fasta

其中，--mod 表示启用甲基化修饰分析；--modprob 是修饰概率阈值（默认是0.8）；--ref是参考基因组文件(用于鉴定CpG位点）

5. RNA-Seq数据（示例）

对于RNA-Seq数据，LongReadSum可以计算转录完整性数值（transcript integrity number，TIN）。

$ longreadsum bam -i input.bam -o output_directory --genebed gene.bed --min-coverage 10 --sample-size 100

其中，--genebed：基因 BED 文件；--min-coverage：最小覆盖度，默认为 10；--sample-size：样本大小，默认为 100。

6. PacBio未比对的BAM文件（示例）

$ longreadsum bam -i input.bam -o output_directory

7. ONT POD5文件（示例）

ONT POD5 文件是 Oxford Nanopore 测序数据的一种格式，包含原始信号数据。LongReadSum 支持对 POD5 文件及其对应的 basecalled BAM 文件进行质控分析。

#单个文件
$ longreadsum pod5 -i input.pod5 -o output_directory --basecalls input.bam

#目录中的多个文件
#如果你有一个包含多个 POD5 文件的目录，可以使用通配符批量处理
$ longreadsum pod5 -P "input_directory/*.pod5" -o output_directory --basecalls input.bam

#指定读取 ID 
$ longreadsum pod5 -i input.pod5 -o output_directory --basecalls input.bam --read_ids "read_id1,read_id2"

#指定采样数量
$ longreadsum pod5 -i input.pod5 -o output_directory --basecalls input.bam --read_count 5

• -b, --basecalls 用于信号提取的 basecalled BAM 文件路径；-r, --read_ids从文件中提取的读取 ID 列表（逗号分隔）；-R, --read_count从文件中随机采样的读取数量
• 需要生成带有move table输出的 basecalled BAM 文件。例如，对于 dorado，参数是 --emit-moves。

8. ONT FAST5文件（示例）

ONT FAST5文件是 Oxford Nanopore 测序数据的另一种格式，包含原始信号数据和 basecalling 信息。LongReadSum 支持对 FAST5 文件进行信号和序列质量的质控分析。

#信号质量分析（Signal QC）
$ longreadsum f5s -i input.fast5 -o output_directory

#序列质量分析（Sequence QC）
$ longreadsum f5 -i input.fast5 -o output_directory

• -r, --read_ids从文件中提取的读取 ID 列表（逗号分隔）；-R, --read_count从文件中随机采样的读取数量。

9. FASTQ和FASTA文件（示例）

#fastq文件
$ longreadsum fq -i input.fastq -o output_directory


#fasta文件
$ longreadsum fa -i input.fasta -o output_directory

10. 实际运行

一般来说对于.fastq和PacBio的未比对.bam文件最为常见，下面以.fastq数据格式为例。1_raw_fastq文件夹存放需要质控的数据文件，1_longreadsum存放结果文件。

# 示例
$ longreadsum fq -i $INPUT_FILE -o $OUTPUT_DIRECTORY  #单个样本


# 实际运行, 会自动生成-o 的路径
$ longreadsum fq -i 1_raw_fastq/Case_1.fastq -o 1_longreadsum/Case1
$ longreadsum fq -i 1_raw_fastq/Case_2.fastq -o 0_longreadsum/Case2
$ longreadsum fq -i 1_raw_fastq/Case_3.fastq -o 0_longreadsum/Case3
$ longreadsum fq -i 1_raw_fastq/Control_1.fastq -o 0_longreadsum/Control_1
$ longreadsum fq -i 1_raw_fastq/Control_2.fastq -o 0_longreadsum/Control_2
$ longreadsum fq -i 1_raw_fastq/Control_3.fastq -o 0_longreadsum/Control_3

缺点是无法直接识别.fastq.gz文件。为了节省硬盘空间，在做质控前需要将压缩文件先解压，然后质控完再压缩回去，对于较大的数据整个过程比较耗时。

四、输出结果

LongReadSum生成的质控报告包括HTML（图2）和文本格式的文件，包括：

• 碱基质量分布：展示测序数据的碱基质量分布情况。
• 读长分布：分析测序读长的分布范围。
• 甲基化修饰分析：对于带有修饰信息的BAM文件，报告修饰位点的分布。
• 转录完整性数（TIN）：对于RNA-Seq数据，提供TIN分数的统计信息。

图2.LongReadSum报告示例截图

参考文献

1 Perdomo, J. E., Ahsan, M. U., Liu, Q., Fang, L. & Wang, K. LongReadSum: A fast and flexible quality control and signal summarization tool for long-read sequencing data. Computational and Structural Biotechnology Journal (2025).