如何用少量样本做m6A研究

生信交流平台

发布于 2020-08-05 09:52:16

1.7K0

N6-甲基腺嘌呤(m6A）是分布最为广泛且保守的RNA修饰。在人类细胞中，目前在近7000个蛋白编码RNA和noncoding RNA中发现了大约10000个m6A修饰位点。作为转录后调控的重要途经之一，m6A修饰影响着RNA剪切，降解，pre-miRNA产生和蛋白翻译等各个阶段，并且在癌症的产生和进程中也起着重要的作用。

图1：m6A修饰对mRNA的多重调控 (Shi et al., 2019)

MeRIP-Seq是目前m6A修饰研究中最为常用的技术之一，但传统的protocol中，需要8-9μg的mRNA，也就是300μg的总RNA。这么多的RNA量有时候很难从癌症病人样本中获得，这也就限制其在临床癌症研究中的应用。

m6A测序方法的不断优化，让我们进一步有更多可能去研究m6A的方方面面

2018年，多伦多大学的何厚胜课题组对MeRIP-Seq的实验流程进行了优化，将样本需求降低至2μg总RNA，打破了传统protocol的限制。相关实验优化数据发表在同年的PloS Biology上，标题为《Refined RIP-seq protocol for epitranscriptome analysis with low input materials》。让我们一起来看看这篇文章对MeRIP-Seq做了哪些优化吧：）

细节性的优化至关重要，一起来围观学习

1、对片段化、清洗和洗脱条件的优化

RNA片段化时的buffer温度从94℃降低至70℃，这样可以降低因Dimroth重排而产生的m1A修饰向m6A修饰的转化，确保检测的真实性。
将RNA片段化的大小从100nt提高到200nt，这样可以将RNA片段的获得量提高2倍。
先使用有m6A修饰的control RNA（GLuc）和无修饰的control RNA（CLuc）的混合样品（1：4）对三种IP后清洗和洗脱的方法进行比较，发现方法二处理后，能够获得更好的信噪比。对IP下来的RNA按照方法二进行第二轮的IP处理也会增加信噪比。类似结果在人肺癌细胞系A549的实验中也得到了验证。

图2：三种样品清洗方法对实验信噪比的影响

2、对MeRIP-Seq数据分析中Peak calling和motif分析pipeline的优化

目前对MeRIP-Seq数据进行m6A peak calling分析的软件有两类，一类是早先为ChIP-Seq数据分析所研发的软件，如MACS；另一类则是专门为转录组m6A位点检测而开发的如exomepeak，HEPeak及在前两者基础上发展的MeTPeak。

利用已发表的两份MeRIP-Seq数据，对MACS和MeTPeak两种方法进行了对比，发现尽管MACS可以获得更多的Peak数，但使用MeTPeak所获得m6A Peaks更具有m6A主要发生的位点RRACH（R=G or A; H=A, C, or U）这一motif的富集的特点，在MACS 单独发现的Peaks中有超过20%的Peaks分布在TSS这一m6A修饰较少发生的区域，此外，MeTPeak的分析具有链特异性，并且能更好的在剪接的外显子（junction exons）区域发现Peaks，因而在MeRIP-Seq数据分析中，MeTPeak更为适用。

图3：两种MeRIP数据分析方法的比较

3、对MeRIP中使用的anti-m6A抗体的检测

抗体质量对能否真实高效的检测m6A修饰位点来说，是至关重要的。文章对来自三家公司（Synaptic Systems, NEB和Millipore）的anti-m6A抗体进行比较。比较spike-in的阴性对照和阳性对照RNA GLuC和CLuc进行实验后的信噪比，发现使用NEB和Millipore的抗体都可以获得100倍以上的信噪比。三种抗体所获得的Peak的重叠率约为60%， peak都在常发生m6A修饰的终止密码子附近有富集。使用NEB和Millipore抗体所获得的Peak都体现了m6A的moitf特征-GGAC有明显富集。

图4：三种抗体在MeRIP实验中的表现

优化结果怎么样？来，上数据！

将32μg总RNA的 MeRIP-Seq数据与已发表的300μg总RNA的MeRIP-Seq数据进行了比对，发现有大量的m6A peak重叠，表明使用优化的MeRIP实验流程，用32μg总RNA是没问题的。

图5：32μg起始量的peak文库与300μg文库（control）的比对

32μg的样本量也很难保证？那就再优化优化，寻求更低的样本量！

4、进一步降低总RNA的样本量

为了能进一步降低对样本量需求，因而对32μg、12μg、6μg和2μg的总RNA样本进行了实验比对，发现2μg总RNA比较适合进行low-input 的MeRIP-Seq。将用32μg RNA与2μg RNA的实验结果的peaks进行比对，发现peak有相当数量的重叠，而且unique peaks更倾向于落在相对低表达的基因上。从2μg样本中所获得的peak和其他更多RNA样本用量的peak一样， m6A修饰在终止密码子附近有富集，同时GGAC修饰位点也有显著富集。

图6：2μg样品量文库与其它文库的比对

低微量样本的MeRIP-seq结果究竟如何，那就用事实说话！

5、应用验证

利用改进后的protocol，使用2ug总RNA的起始量，对两位肺腺癌患者的癌症样本进行MeRIP-seq检测。每份样本最终获得近12000个peak，发现在953个基因上有差异peak，209个基因可以检测到蛋白质水平上的差异。证明这一改进的低样本量的MeRIP-Seq流程可以适用于样本量受限的癌症等方面的研究。