GRK3 通过 CB2R 磷酸化加剧糖尿病心肌损伤机制 | MCE原创

直播间的小伙伴们大家好，欢迎来到MCE的主题直播间，我是今天的主持人小M，非常感谢大家的热情关注，MC持续致力于分享前沿干货，伴随科研人员的成长，我们的一座论坛直播栏目呢，会定期邀请到高分文章的作者来与大家进行分享和经验交流，那今天呢，我们的直播主题是G蛋白偶联受体激酶3通过磷酸化二型大麻素受体加剧糖尿病的心肌损伤，那这篇文章呢，是今年。8月发表在国际心血管。领域的顶级期刊circulation上面，然后本期的主讲嘉宾呢，就是我们这篇文章的第一作者，很高兴的是邀请到了来自于复旦大学附属中山医院的高攀老师，然后高老师及其团队的研究方向呢，是有关于大马素受体与心肌损伤的分子机制，重点呢是去探究不同的亚型大麻素受体在糖尿病心肌损伤中的反应作用的一个效应。

嗯，说到糖尿病，相信就是直播间的小伙伴们也是非常的熟悉的，这样的一个代谢类的疾病，它本质上呢，是由于胰岛素分泌不足，或者说胰岛素的作用功能障碍所导致的，是一种以高血糖为特征的慢性代谢性的疾病。糖尿病呢会导致多种并发症的发生，其中呢，糖尿病的心肌损伤就是一种隐匿且后果非常严重的一种并发症，那这样的一种并发症呢，实际上是独立于冠心病和高血压之外的一种心脏结构和功能的异常，这种损伤呢，通常会导致心脏的扩大，心脏泵血或者充盈功能的下降，最终引发心律衰竭，心律失常，甚至猝死。那今天我们要分享的研究结果呢？主要是揭示了质蛋白偶联受体激酶3在糖尿病心肌损伤中的关键作用及分子机制，并且呢，在整个研究过程中。

前期呢是对于整个这个质蛋白有莲受体激酶3的功能进行了阐述，最后呢，整篇文章通过于虚拟筛选技术进一步的发现了小分子抑制剂抑氯盐酸能够高效且特异的抑制JK的活性，为糖尿病的心肌损伤治疗提供了新的潜在候选药物和治疗方向。如果在老师的分享过程中呢，大家有任何疑问可以在评论区中提出，我们将在答疑环节呢为大家一一的进行解答，那现在呢，让我们热烈欢迎高老师上线时间交给高老师。老师，您这边可以开启屏幕共享了。谢谢，谢谢主持人啊，也谢谢MC公司的介绍，呃，能听到我的声音吗？哦，可以的老师。

嗯，今天我就给大家分享一下我们近期刚刚发表的一个工作，嗯，他呢是一项从临床问题出发，然后到分子机制的深入探究，最后回归临床的这样一个工作介绍。那么，呃，作为心血管人呢？我们都知道心血管疾病是导致人类死亡的主要特点，那么心力衰竭是心血管疾病死亡的一个主要原因。从而使其从细胞膜转位进入到细胞浆中，这也就是我们说的呃，GPCR的一个经典的内化的现象。那么内化的GPCR之后呢？会被呃或者是被换单数化降解，或者是会发生一系列非经典的信号通路。那么我们课题组都是呃，围绕着GPCR展开工作的，其中一个很重要的原因呢，就是目前约有1/3的小分子药物都是反向于GBGRR的，比如说在心血管疾病中，嗯，我们已经证实了血管紧张素的受集就是a tone a tone.

的受体，呃，抑激剂，沙坦类或者是内皮素受体的抑激剂呢，都可以被用来治疗临床上的高血压，白塔受体的抑激剂呢，可以用来治疗心理衰竭，IL万受体的抑肌肌呢，嗯，可以用来治疗动脉粥样硬化。那么尽管如此呢，目前针对某一些特定的心肌损伤类型。比如说糖尿病、心肌病，他们还没有很好的基DCR药物。那么在我们的研究中呢，我们就证实了大麻素受体可能在其中会发生一个中呃关键的作用，大麻素受体它是属于内源性大麻素系统的，这个系统中主要呃是两类呃大麻素受体，1型大麻素受体就是CB万CB问呢，它主要是在中枢神经系统中高表达，而二型大麻素受集CV two, 它多在外周的一些免疫器官中受集。

但是包括我们课题组以及其他很多的研究团队呢，都证实了，嗯，这两个受体在心血管疾病中，他们是发挥的一种截然相反的作用，存在着一个反射作用的效应。呃，比如说我们前面已经证实了，嗯，一型大麻素受体，它在代谢紊乱的时候呢，是会表达上升的，它可以通过特定的三酸位点反会进入到细胞浆中，那么细胞浆中的cb one呢，它可以通过特定的呃B基酸序列与n n RP three胶往小体形成复合物，从而促进n RP three交往小体的稳定性，最终导致细胞凋亡。不管是基因或者是药物层面去干预，一些大麻受收集都能够缓解代谢紊乱所导致的这种心脏毒副作用。那么这是一型大麻素受体的作用，我们关于2型大麻素受体进行了一系列的研究，我们呃二三年的一个工作呢，我们就证实了2型大麻素受体它可以通过嗯转动因子BA two来抑制坏死性凋亡，型号通用，那么坏死性凋亡的效应分子那LKL，它确实可以反过来磷酸化CV two导致它的呃表达下降。

那么这样的话，Cb two BA two和MLKL就形成了一个环路，我们当时给他面临了一个叫做坏死型交王环这样一个。名词。呃，那么这两项工作呢，我们就证实了，嗯，大麻素受体在心血管疾病中，呃，确实是一种可呃可能的干预靶点。嗯，但是尽管如此呢，嗯，虽然文章已经发表了，但是其实还是存在着一些尚未解决的关键的科学问题，比如说在疾病的状态下，这些大麻素受体是如何从细胞膜转位进入到细胞浆中发生这样的内化的过程。就比如说呃，我们其实知道大麻树受体的一个机动剂，它本质上是属于一种大麻，虽然在欧美的许多国家呢，大麻的使用已经合法了，但是在们中国还是没有的，呃，它的安全性还是有待商榷的，因此呢，我们就在想，是不是有某一些替代方案可以替代这种呃，亚麻素受体的这种机动性在临床上的使用。

呃，或者换一种说法，就是说，呃，大麻素受体的上游信号是不是能够发挥这样的功能？那么前面我们也提到，蛋麻素受体作为典型的GPCR，它的上游信号应该就是细胞浆中的这种肌蛋白。我们受体激酶。那么我们知道肌蛋白偶联素体激酶家族，它其实是有七个成员的，1234567，呃，那么我们知道1和7呢，它主要是在视网膜中是高表达的，而4GRK4呢，它是在性器官中普及的，2356这四个呢，则是全身性的表达。嗯，那么我们就在想，这些肌蛋白，我们受体激酶到底是哪一个在我们的糖尿病心理选项中是发挥的主要的作用？

为了回答这个问题呢，我们首先在数据库中进行了一个分析，我们发现在C，呃，CBQ的3~5位点的加K3这个接接蛋来，我们说点肌酶是可能会促进它的磷酸化的。因此呢，我们就接呃，展开了接下来的一系列研究，嗯，这是我今天汇报的一个主要提纲。首先呢，我们。筛阉了一个糖尿病心肌损伤中的一个新的靶点，也就是我们的肌蛋白5元素体肌酶3，随后呢，我们就在就继续深入研究的肌蛋白5年受体积能下3的一个下游的信号通路。呃，然后呢，我们也研究了它的一个项目的调控网络，最后为了临床转化呢，我们也进行呃，一系列的药物。转化方面的，呃，研究。嗯，那么首先呢，我们是在糖尿病心肌病中，我们呃，为了筛选出来到底是哪一个鸡蛋白黄素机能发挥主要的作用，那么我们首先是进行了一个单细胞数据的分析啊，这里我们可以看到在糖尿病的。

嗯，小组肾脏中呢是呃，GRK3，它确实是在心肌细胞中特异性的过表达了，它在成纤维细胞，内皮细胞或者是脂肪细胞中，它的表达含量呢，是相当相当少的。嗯，当然我们也分析了其他的几个肌蛋白5们受体肌内，我们发现除了7是完全检测不到的之外呢，嗯，其他的这几个12456，它都会在多种细胞类型中表达上调，嗯，当然这些数据库的一个分析，嗯，我们也展开了，呃，一定的实验去进行一个验证，那么在这里呢，我们是分离了大鼠的原代的心肌细胞，全纤维细胞和内皮细胞，嗯，进行了QPCR的检测，啊，同样的这个这里也是7是完全检测不到的，那么。123456呢，都是在呃，多种细胞类型中存在的一个表达变化的，在这里我们可以看到GRKC呢，它确实是在心肌细胞中表达上调了，嗯，所以呢，接下来我们还进行了一个实验，我们就将这个2356这四个全限性表达的GRK呢给它分别用SSHRNA干扰的方法进行嗯干预，我们就发现由高糖所导致的一系列的心肌损伤指标呢，比如说这里的NT和BMT，它代表的是一个心肌肥厚，然后CT GF calling one以及calling four呢，它代表的是心肌显维化，DNF阿尔法IR six和TRR问贝塔，它代表的是心肌炎症，我们就发现这些高糖所导致的这些指标呢，嗯，都会被GRRK3的超除所一致性的逆转。

嗯，那么到这里我们就基本上锁定了GRK3，它可能是在糖尿病经肌细胞中变化呃最明显的一个，嗯，接下来呢，我们就收了人体样本，嗯，在这里我们一共收集了34对34个糖尿病的呃，人体的心脏组织，然后就通过组织学的方法进行染色定量，嗯，我们就发现GRK3它确实是在糖尿病的心脏中表达上升的，并且它是心脏的，呃，显化心脏的肥厚的程度呢，呈现显著的正相关。

那么我们也构建了呃，小鼠模型，嗯，这里呢，我们分别构建了两种小鼠模型，一种上面的这一种呢，是DB滴B不同周龄的DBDB这种自发性的2型糖尿病小数，那么下面这个是用高脂加SDV诱导产生的这种2型糖尿病小数，我们确实也证实了，嗯，GRK3在这个糖尿病心脏中是表达逐渐上升的。嗯，最后我们也在细胞模型上进行了证实，嗯，左边这个是我们体外培养的心肌细胞系，然后还包括元代，右边是原代心肌细胞，我们都证实了GRK3在糖尿病心肌细胞中表达上升。

那么这种表达上升是否是能够发挥一定的功能呢？我们接下来就进行了72K3的干预的实验，首先呢，我们是在细胞上做了这样一个实验，嗯，我们在这里左边我们就可以发现高糖是会导致心肌损一系一系列的心肌损伤，呃，指标的上升的，如果加K3倍过表达的情况下呢，这一系列的心肌损伤会进一步的加剧，但是如果GRK3被敲除了之后呢，这些心肌损伤的指标会得到逆转，这就说明了GR压K3确实是能够发挥功能的。当然我们也构建了一个呃，体内的模型，这里我们构建了一个GRK3心肌细胞特异性敲除的这样一个小组模型，那么我们就发现在野生型的小组中，野生型的糖尿病小鼠是会表现出来。嗯，一系列的，包括射血分数的下降，包括心脏中会出现一系列的炎症，细胞纤维化，或者是心肌细胞会出现一定的肥大，这一系列的心肌损伤指标呢，都会在GRK3心肌细胞特异性敲除的这种小鼠中得到逆转。

呃，我们也收集了这批小组的血清样本，经济类拿下的检测，我们这些实验呢，就都证实了心肌细胞特异性敲除GRK3，它是能够缓解糖尿病心肌损伤的。呃，那么到这里我们就筛选出来了GRK3，它可能是糖尿病心肌损伤变化中的一个重要的干预靶点。那么。它的下游信号通路是不是我们前面所呃关注的大码数受体呢，嗯。在前面的文章中呢，其实我们也证实过了，在大麻素受体它是在糖尿病心肌损伤的过程之中是表达下降的，而且呢，嗯，我们也通过免疫荧光以及核浆膜分离的这样的实验呢，我们证实了大麻素受体在高糖存在的情况下是会内化的，都会从细胞膜转位进入到细胞浆中的，那么GRRK3在这个过程中是否能够发挥一定的功能，我们首先就进行了一个免疫荧光的，呃。

检测，嗯，在这里我们可以看到高糖高糖处理的GBQ呢，它确实会是会从细胞膜岗位进入到细胞浆中，发生这样一个内化的过程。如果加K3被过表达的这种内化的现象呢，会更加明显，但是如果加K3被敲除了之后呢？Cb two将不再发生内化，它会维持在这个细胞膜上的存在，嗯，这就说明了GRK3，它确实是调控了c b two的一个细胞器的定位，就是它的内化的过程。那么内化的c b two又会怎样？嗯，我们就是想检测一下它的磷酸化过程，磷酸化的水平。因为这里我们本来也是构建了一个cp two, 呃，335位点这样一个特异性的磷酸化抗体，但是这个位点可能是一些特殊的结构在，所以呢，我们当时抗抗体构建也并没有成功，所以呢我们还是用了一个泛四氨氨苏氨酸的这样一个抗体就检测了呃，C v two的磷酸化，那么我们就发现GK3它是能够促进cb two的磷酸化的。

嗯，那么嗯，它是否能够调控它的功能呢？我们在这里就进行了一系列的回复实验，比如说我们在呃过表达GRK3的同时呢，过表达的cb two, 或者是敲出了cb two, 又或者是用药物层面去激活CBQ，这样一系列的回复实验呢，我们就证实了GRRK3呢，它不仅调控了CPU的定位，嗯，调控了它的磷酸化，也调控了它的功能。那么前面我们也讲到，呃，Cb two的内化，它是有一条经典的贝塔restt信号通路的，嗯，那么呃，我们在这里就在进行了一个检测，嗯，那么左边呢，我们是用了贝塔restsin的SRNA，右边呢，我们是用了贝塔sin的抑制剂，就是这个barbin这个抑制剂，我们发现不管是在基因或者是用药物层面干预了贝塔reststin之后呢，Cb two啊的内化过程都会被受到抑制。

这就说明了cb two的内化，呃，在这里也确实是通过了经典的贝塔restsin信号通路的，呃，那么GRRK3是否是这条信号通路的一个上游呢？嗯，我们在这里又进行了一个实验，那么这里的荧光呢？我们可以看到GRK3的过表达或者是高糖呢，都能够导致CD two的内化。嗯，但是如果在G+K3或表达的同时，我们加了巴B点这种贝塔restsin的抑制剂之后呢？Cb two将会维持在这个细胞膜上的定位。嗯，它不再发生内化，这就说明了GRK3出现cb two的内化确实是通过这条呃，经典的贝塔resting信号通路的。

呃，那么它的作用位点又是不是我们前面所预测的335位点呢？呃，为了回答这个问题呢，我们首先是用crystal caline的方法构建了一个cp two全KO的这样一个心肌细胞系。然后呢，我们将c b two野生型的，或者是c b two335位点突变的这样的指粒传染到这个细胞系中去，嗯，我们就发现，嗯，CK3呢，它是能够促进野生性的cb two转位进入到细胞浆的，但是如果335位点被突变了之后呢，GRRK3将不再发挥作用，Cp two会维持在这个细胞膜上的存在。嗯，这就说明了GRRK3，它确实是通过cb two的335位点，嗯，促进了它的内化，那么内化之后的cb two又发，呃，又发生了什么，他的命运最终是怎么样的？嗯，首先呢，就检测了他的一个范数化的水平。嗯，我们通过了一系列的。

一系列的实验，比如这里的我们用了一个呃，泛素化的一个泛泛素化的抗体，我们也用了嗯，泛素活化酶1万的一个抑制剂，呃，这就是这里的PYR24541，也用了蛋白酶体的抑制剂MG132，嗯，这一系列的实验呢，我们就证实了cb two被内化了之后，它其实是被淡珠化降解。但是如果3~5位点，这个位点被突变了之后呢？Cp two不再发生内化，那么它的降解途径是受到抑制的。呃，那么到这里我们就证实了GRK3呢，它确实是通过促进CPQ335位点，呃。的磷酸化最终导致了它的泛酸化降解，呃，那么呃，最终导致它的表达减少，那么这种表达减少是不是能够发挥功能呢？嗯，我们又进行了这样一个实验，嗯，我们也是在这种呃335味点突变，或者是野生型的这种这种滚转株里面，我们发现在野生型的cb two细胞中呢，我们加入GRRK3过表达了之后呢，它是能够加剧呃这一系列的心肌损伤指标的变化的，但是如果335位点被突变了之后呢，这一系列的经肌损伤指标并不发生改变，同样的，如果嗯超出了GRK3热话呢，也不会发，也不会溶解呃这种糖尿病所导致的心肌损伤。

嗯，这就说明了cb two被降解了之后，确实是会导致一系列的损伤效应的。当然我们也在动物模型上进行了验证，在这里呢，我们又构建了一个c b two心肌细胞特异性超毒的这样一个糖尿病小组，然后呢，心脏原位注射了GRK3的腺，呃，GRK3超图的腺相关病毒，那么我们就看到嗯，在糖尿病在也生前的糖尿病小鼠，呃，挑除加K3的话，它是能够逆转这种糖尿病所。呃导致的心肌损伤呢？比如说这里的呃EFFS，以及我们呃外粉中看到的这一系列，包括心肌肥厚，炎症以及显膜化的这一系列的主张指标都会得到一定程度的恢复，但是如果CV two被CK了之后，我们在这个时候呢，在敲除GRK3，它并不能够逆转糖尿病所导致的心肌损伤。

嗯。嗯，这里也是同样的，我们还通过QPCR，或者是免疫组化等等实验都证实了GK3呢，它是嗯，作用于cb two, 然后导致糖尿病心肌损伤的。那么到这里我们就证实了GRK3它的下游是cb two, 嗯，它是通过磷酸化cb two的三叉五号位点促进了它的泛冲化降解，致了他在细胞将，嗯，导致了他在细胞中的表达下降，那么这种C维特的表达下降就会最终加剧糖尿病进经损伤。嗯，这里我们是讲了GRK3的一个下游信号，那么GRK3的上游信号又是怎样的呢？

为了回答这个问题呢，我们进行了一个经典的DNA脱档加呃质谱引用的一个方法，嗯，我们首先克隆了一系列的用生物素标记的嗯引物呢去扩增的GRK3的启动子，然后用词株去复极洗脱，然后将最终拿到的这一系列蛋白送去打质谱，在质谱见定到的这一系列的蛋白中呢，我们发现有11个转因子。那么我们就将这11个转动因子呃，在DBDB这种糖尿病小组的心脏样本中进行了验证。我们发现y one是。其中变化最显著也是最稳定的一个。那么y one是否在其中发挥功能呢？我们又经过了一系列的呃，细胞生物学及分子生物学实验，呃，比如说这里的染色质免疫共沉淀M萨嗯，定点突变、荧光素酶报告基因等等实验，我们就证实了阴阳因子就是y one呢，它是能够结合到加K3启动子的。

-3868到-1374这一个片段性式，从而转入抑制了TK3的表达。嗯，当然我们也进行了一系列的回复实验，比如说我们同时干预了GRRK3和y o one, 就会发现这y o one所导致的这一系列的损伤，这一系列的，嗯。表达变化呢，会被加K3首逆转。嗯，当然我们也构建了一个动物模型，我们这里是在GRK3心肌细胞特异性的敲除的小组，模型小组。糖尿病小组中心脏原位注射了Y弯的腺消除的腺相关病毒，那么我们在这里我们发现，如果在野生性的糖尿病小组，呃，心脏敲突歪万，它是能够加剧糖尿病心肌损伤的，嗯，这里我们可以看到他的炎症细胞的复肌，看到他的纤维化，看到他它的以后这一系列损伤指标都是被加剧了的。

但是如果在GRK3CTO的这样小组模型中敲除y one, 它并不加剧这一系列的损伤，这就说明了GRK3确实是y one的一个下游环节。哦。嗯，这里也是，这里也是这个动物模型，这里，嗯，这里是设计工作，嗯，FS以及一些QPCR的检测。呃，这是血清样本，就是我娃化的结块，嗯，我们看到MP和BMP代表的血清肌体后，呃，T节贝塔旺和con one代表是心肌小化，IR six和TNF八法代表的是心肌的炎症啊，那么这一系列的实验呢？我们就证实了y one+K3上游的一个调节蛋白。那么我们到这里就不仅证实了GRK3的下游信号是cb two, 那么它的上游信号是y oy, 那么YYGRK3到cb two这样一条信号网络，嗯，对我们的临床干预会有怎么样的指导价值呢？

嗯，说到指导架，说到临床干预呢，我们就进行了，我们想要筛选一个GRK3的一个小分子抑制剂，嗯，那么这里我们就采用了一是一个虚拟筛选的方法，嗯，我们是将MC公司呢，他们，呃，这个库里面所有的有活性的小分子化合物概有19100多种，我们将这100的将这些化合物呢，分别于GRK3的蛋白结构进行了一个虚拟的对接，然后就将这19100多种化合物呢进行了一个排序打分。那么我们将排序前30的这30个化合物拿来进行呃，活性的验证，嗯，因为现在加K3，它其实还没有很成熟的，呃。活性的一个检测的方法，嗯，没有说有，呃，也没有什么拉下的检测试剂盒，所以呢，我们就用了，我们文章中发现了它能够调控c b two的磷酸化，用磷酸化的c b two的含量呢作为一个减除的指标，那么我们发现这30个化合物中，除了第12个和第22个有严重的细胞毒性被排除了之后呢，我们发现这排名第二的这一个小分子化合物，也就是这里的ICQA，它是能够最大程度的抑制CBQ的酸化的。

同时呢，它也是能够最大程度的逆转高糖所导致的这一系列的心肌损伤的。嗯，这里呃，比如说右边的经六狗可以看到高糖是会导致这一系列心肌损伤的，但是加了嗯，RQ这个药，ICQA这个药呢，嗯，这一系列的心肌损伤会得到最大程度的逆转，因此呢，我们就将呃。药物的，呃，潜在的药物初步。

聚焦于ICQA，嗯，那么这里是活性验证，接下来呢，我们也进行了一个结合能力的验证，虽然虚拟筛选中，呃，这个ICQA它是排名第二的，当然我们还是需要进行一定的实验进行验证的。那么这里我们就进行了一个B口实验，就是表面的离子共振实验，来进行了一个温度梯度实验，我们就证实了ICQA这个小分子药物呢，它是能够与GRK3直接结合的，而且嗯，我们的预测也是发现它有5个可能的结合位点，我们就将这5个结合位点给它突变掉，我们就发现如果突变了之后，GRK3就与icq也不能够结合了。嗯，当然我们也将这5个结合位点给它分别进行突变，我们发现呃，突变任何一个的时候呢，IC突间它还是能够造成一定的保护作用的，但是如果5个位点同时被突变了之后呢，嗯，它的功能会被完全逆转。

这就说明了这5个位点可能或多或少都会发生一定的功能。当然我们也将ICQA这个小分子药物能与其他的几个GRK进行了呃结合能力的一个呃对接，我们就发现ICQA它与ZRK3的结合能力是最强，而且是最稳定的一个。呃，那么作为一个潜在的治治疗药，临床药物呢？我们当然是要在首先在动物模型上进行一个初步的验证，我们就将icctv注射到糖尿病小组的腹腔中，我们就发现糖尿病小组所表现出来的这一系列的心肌损伤呢，会给ICQA所逆转。呃，这就说明了ICQV它是能够发挥一定的功能的，当然我们也收集了其他的一些重要脏器，比如说肺脏、肝脏、肾脏、脂肪、脾脏和以及脑，我们都发现iccta它会对，它对其他的脏器呢，不会产生额外的损伤，这就说明了iccta这个药物呢，还是具有一定的安全性的。

那么到这里，这个故事就基本上结束了，嗯，我们呃进行一个总结，首先呢，我们就证实了GK3，它是糖尿病经肌损项变化中最明显的一个肌蛋白网受体肌酶，它下游是可以通过CBQ，嗯的3+5后物三酸位点促进CBQ的磷酸化，导致cb two内化进入到细胞浆中被泛珠化降解。呃，从而就加剧了糖尿病的心肌损伤，那么它的上游是会被转入因子y one, 呃来转入调控的。那么我们所筛选到的GRK3的小分子抑制剂呢？ICQA或许能够成为呃临床上替代大麻使用的这样一种，呃。治疗糖尿病心肌损伤的一种潜在的治疗药物。呃，那么我们这个课题中其实用到了MT公司许多许多的画图，比如说我们前面所讲到的贝塔rest的抑制剂，Cb two的机动剂，肌和1万一万的抑制剂，蛋白酶体的剂，嗯，最重要的是我们用用应用了他们一个虚拟筛选的一个这样的一个功能。

嗯，在此呃，也对MC公司表示一个感谢啊，最后谢谢大家。啊，我汇报我的报告就到这。谢谢。