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分子生物学实验技术——荧光素酶实验
荧光素酶报告基因实验就是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。 荧光素酶（Luciferase）：是能够催化底物氧化发光的一类酶的统称。 3️⃣加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。 二、双荧光素酶报告系统（Dual-Luciferase reporter assay） Dual-Luciferase双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者可催化各自的底物发生氧化作用产生生物荧光 ，以萤火虫萤光素酶为核心reporter，海肾荧光素酶作为内参，构建研究对象到相应位置，转染细胞，裂解细胞，分别加荧光素酶底物，用荧光测定仪检测荧光强度，通过数据得出基因表达量，从而确定构建序列的功能。 双荧光素酶报告基因检测系统中的luciferase来源于细菌、萤火虫、发光海洋生物等，可以在哺乳细胞中直接表达，无需表达后修饰，直接具备完全酶活性。
1.8K30编辑于 2023-02-23 - 来自专栏生命科学
细胞转染、重组蛋白、荧光素酶检测试剂盒实验 | MedChemExpress
“六合心法”第三式 ■ 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 (Renilla-Firefly Luciferase Dual Assay Kit) 荧光素酶是自然界中能够产生生物荧光的酶的总称，可催化荧光素氧化成氧化荧光素 目前最常见的荧光素酶是萤火虫荧光素酶 (Firefly luciferase) 和海肾荧光素酶 (Renilla luciferase)，前者用于荧光素酶报告基因的检测，后者则作为内参，消除细胞生长状态 本心法中的 Renilla-Firefly Luciferase Dual Assay Kit 含有高纯度的 D-荧光素、腔肠素以及比例优化的反应缓冲液，可实现哺乳动物细胞双萤光素酶报告基因检测，操作简单 、检测快捷、灵敏度高。 Renilla-Firefly Luciferase Dual Assay Kit 含有高纯度的 D-荧光素、腔肠素以及比例优化的反应缓冲液，实现哺乳动物细胞双萤光素酶报告基因检测。
47510编辑于 2023-03-03 基于荧光素酶报告基因系统的信号通路与基因转录活性检测
一、报告基因检测技术的原理与应用价值荧光素酶报告基因检测是一种广泛应用于生物医学研究的强大工具，用于在活细胞或细胞裂解物中定量、实时地监测特定信号通路的活性或基因的转录水平。 激活的转录因子复合物与报告质粒上的SRE序列特异性结合，从而驱动荧光素酶基因的转录与表达。因此，通过检测荧光素酶的活性，即可定量评估MAPK/ERK通路的激活程度。 4.专为双报告基因系统优化：系统设计能够很好地支持双报告基因实验（例如，同时使用萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为内参对照），便于通过比率法归一化处理，有效校正转染效率差异和细胞活性变化带来的变异 3.荧光素酶活性检测：处理结束后，裂解细胞。使用UA-Glo®Bio-lucLuciferaseAssaySystem按顺序检测萤火虫荧光素酶（实验组）和海肾荧光素酶（内参组）的活性。 4.数据分析：将萤火虫荧光素酶的活性值与对应的海肾荧光素酶活性值相除，得到归一化的相对荧光素酶活性。
22310编辑于 2026-01-30【辰辉创聚生物】报告基因细胞系构建与应用技术解析
报告基因系统的工作原理基于将特定信号通路响应元件与报告基因相连接，当目标信号通路被激活时，响应元件驱动报告基因表达，通过检测报告蛋白活性或荧光强度即可定量分析通路活性水平。 常用的报告基因包括萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、绿色荧光蛋白及其变体等，每种报告基因具有独特的检测特性和应用优势。 报告基因选择与载体设计报告基因类型与特性荧光素酶报告系统：萤火虫荧光素酶：检测灵敏度高，动态范围宽，适合定量分析海肾荧光素酶：与萤火虫荧光素酶组合用于双报告系统，作为内参对照高斯荧光素酶：热稳定性好，适用于高温环境检测荧光蛋白报告系统 双报告系统设计时需注意两种报告基因的兼容性，通常将实验报告基因与对照报告基因置于不同载体，或通过内部核糖体进入位点连接于同一载体。载体构建完成后需通过限制性内切酶分析和测序验证。 对于荧光素酶系统，需优化底物浓度和检测时间点；对于荧光蛋白系统，需优化激发光强度和曝光时间。稳定性测试将细胞系在常规培养基中连续传代培养，定期检测本底信号和诱导信号。
11710编辑于 2026-01-12- 来自专栏流式抗体推文
3分钟理清细胞状态检测！Elabscience一站式解决方案来了
）低毒性，高活力，高增殖药物无效，癌细胞快速增殖细胞活力测定方法一览检测方法适用仪器核心原理检测时间特点ATP法多功能酶标仪（具备化学发光检测功能）基于荧光素-荧光素酶体系，检测活细胞内 ATP 含量， 产品检测原理：利用荧光素酶与ATP、荧光素的特异性酶促发光反应，且发光强度与 ATP 浓度呈严格的线性正相关，结合活细胞内的ATP含量与细胞活力的正比关系，实现对活细胞ATP的精准定量。 荧光素酶报告基因法化学发光检测仪 / 多功能酶标仪萤火虫荧光素被细胞膜破碎释放的萤火虫荧光素酶催化氧化生成氧化荧光素并发出黄绿色光。25 min高灵敏度，但需要构建报告基因体系。 相关产品推荐产品货号产品名称规格适用仪器应用E-BC-K771-M乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性比色法测试盒96T酶标仪细胞毒性E-BC-F074双荧光素酶报告基因化学发光法测试盒（辉光型）48T/96T DNA 含量流式分析（PI 染色法）流式细胞仪PI 穿透细胞膜嵌入 DNA 双链，荧光强度与 DNA 含量成正比，通过细胞周期分布（G1/G0、S、G2/M 期）反映增殖活性。
18010编辑于 2026-02-02 - 来自专栏简说基因
从零开始学PCR技术（一）：PCR技术简介
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一项利用 DNA 双链复制原理，在生物体外复制特定 DNA 片段的的核酸合成技术。 双链 DNA 在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在 DNA 聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。 退火（Annealing）：在 DNA 双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链 DNA 上。 延伸（Extension）：DNA 聚合酶由降温时结合上的引物处开始沿着 DNA 链合成互补链。 聚合酶链式反应简图 三、结果检测 PCR 反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。 扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及 RNA 均可作为扩增模板。
1.6K10发布于 2020-12-02 - 来自专栏生物信息云
illumina、Sanger、第三代和第四代测序技术原理
荧光染料包括四种不同发射波长的染料标记的双脱氧核苷酸或染料标记的引物，因为每种染料在光激发下产生不同的荧光信号，可由扩增产物的荧光染料鉴定出3'末端双脱氧核苷酸为A，T，C或G。 * 切去叠氮基和荧光基团，开始第二轮测序： 接着将叠氮基和荧光基团切去，液流冲走，重新加入荧光标记的叠氮dNTP和酶，扫描此时的荧光，测出第二个碱基是哪一种。 Chastity 和 Pass filter 为了对光点当中荧光素的纯粹程度进行描述，Illumina公司定义了个标准，叫“chastity”，Chastity的定义就是浓度最高的那个荧光素的量，去除以 “它自己 + 排名第二的荧光素的量的和”。 另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息（图7）。
7.8K30发布于 2020-07-09 - 来自专栏BioIT爱好者
图解三代测序（SMRT Sequencing）
2 构建文库 将样本中的 DNA 或 RNA 分子提取后，构建如下的哑铃状分子结构： 黄色，紫色：双链 DNA 分子 蓝色：接头（Adapter） 将文库分子展开，一个完整的圆环出现在我们眼前： 这种结构有利于进行周而复始的滚环复制 4 上机测序 1、构建测序复合物 测序复合物：聚合酶，测序模板，测序引物 2、复合物撒入测序小孔 3、固定测序复合物 由于聚合酶加了生物素，在芯片玻璃底板有链酶亲和素。 利用生物素和链酶亲和素的亲和力，包含聚合酶的测序复合物会被固定在玻璃底板。 在一个碱基合成结束后，带有荧光基团的磷酸基团会从 dNTP 上掉落，发生猝灭，不影响其他碱基的信号检测。 6、检测碱基甲基化 有意思的是，在 SMRT Sequencing 测序过程中，可以直接测到碱基被修饰的状态，聚合酶遇到碱基上带有甲基化的碱基，合成速度会明显变慢，而且光谱也会发生改变。
2.5K20发布于 2021-10-15 - 来自专栏生信情报站
图解三代测序（SMRT Sequencing）
四、上机测序 1、构建测序复合物 测序复合物：聚合酶，测序模板，测序引物 ? 2、复合物撒入测序小孔 ? 3、固定测序复合物 由于聚合酶加了生物素，在芯片玻璃底板有链酶亲和素。 利用生物素和链酶亲和素的亲和力，包含聚合酶的测序复合物会被固定在玻璃底板。 ? 4、构建带有荧光基团的dNTP 在芯片溶液中含有许多游离dNTP，所谓游离dNTP就是随机飘在溶液中的dNTP。 ATGC四种碱基的dNTP，在磷酸基团上分别带有四种颜色的荧光基团。 ? 5、边合成边测序 在合成时，游离的dNTP被固定在底板上的酶捕获，激发光会从玻璃板底部发出。 ? 在一个碱基合成结束后，带有荧光基团的磷酸基团会从dNTP上掉落，发生猝灭，不影响其他碱基的信号检测。 6、检测碱基甲基化 有意思的是，在SMRT Sequencing测序过程中，可以直接测到碱基被修饰的状态，聚合酶遇到碱基上带有甲基化的碱基，合成速度会明显变慢，而且光谱也会发生改变。
1.5K20发布于 2021-03-05 - 来自专栏生信菜鸟团
图解三代测序（SMRT Sequencing）
4 上机测序 1、构建测序复合物 测序复合物：聚合酶，测序模板，测序引物 ? 2、复合物撒入测序小孔 ? 3、固定测序复合物 由于聚合酶加了生物素，在芯片玻璃底板有链酶亲和素。 利用生物素和链酶亲和素的亲和力，包含聚合酶的测序复合物会被固定在玻璃底板。 ? 4、构建带有荧光基团的dNTP 在芯片溶液中含有许多游离dNTP，所谓游离dNTP就是随机飘在溶液中的dNTP。 ATGC四种碱基的dNTP，在磷酸基团上分别带有四种颜色的荧光基团。 ? 5、边合成边测序 在合成时，游离的dNTP被固定在底板上的酶捕获，激发光会从玻璃板底部发出。 ? 在一个碱基合成结束后，带有荧光基团的磷酸基团会从dNTP上掉落，发生猝灭，不影响其他碱基的信号检测。 6、检测碱基甲基化 有意思的是，在SMRT Sequencing测序过程中，可以直接测到碱基被修饰的状态，聚合酶遇到碱基上带有甲基化的碱基，合成速度会明显变慢，而且光谱也会发生改变。
2.7K31发布于 2021-03-06 流式细胞术凋亡检测指南 | 实验原理、步骤与结果分析详解
在生物医学研究中，准确检测和定量凋亡细胞至关重要。流式细胞术凭借其高通量、多参数、定量的优势，成为检测细胞凋亡的金标准方法。其中最常用、最经典的技术就是AnnexinV结合/碘化丙啶（PI）双染法。 （处理组和对照组）-1xAnnexinV结合缓冲液（通常由试剂盒提供或自配：10mMHEPES,140mMNaCl,2.5mMCaCl₂,pH7.4）-FITC（或其他荧光素）标记的AnnexinV-碘化丙啶 AnnexinV染色：根据试剂说明书推荐量（通常每10⁵-10⁶个细胞加1-5μL），加入FITC-AnnexinV（或其他荧光素标记的AnnexinV）。注意避光操作。轻柔混匀。 代轩生物AnnexinV/PI双染流式凋亡检测服务——为您提供“一站式”精准解决方案，化繁为简，数据确凿！为什么选择代轩生物AnnexinV/PI双染服务？ 严格把控胰酶消化时间（无EDTA酶）、钙离子浓度、避光染色与多重单染补偿对照，确保象限划分绝对准确。✔专业平台，数据可靠无忧高端仪器保障：采用主流流式细胞仪，确保检测灵敏度和稳定性。
80310编辑于 2025-11-13AbMole | Calcein-AMPI细胞双染试剂盒，精准区分细胞活死状态
AbMole推出的Calcein-AM/PI活死细胞双染试剂盒（AbMole，M55257），专为解决这些痛点而设计，它的检测原理基于两种荧光染料：Calcein-AM和碘化丙啶（PI），能够快速、准确地区分活细胞和死细胞 一、检测原理Calcein-AM/PI活死细胞双染试剂盒（AbMole，M55257）内含有Calcein-AM和Propidium Iodide（PI，碘化丙啶），Calcein AM 是在传统的钙黄绿素 Calcein AM本身无荧光，在进入细胞后被细胞中内源性酯酶水解，生成具有强负电荷且不能通过细胞膜的极性分子Calcein并滞留在细胞内，而Calcein可发出强绿色荧光（Ex/Em= 494nm/517nm 由于死细胞缺乏上酯酶，不能或很少能产生Calcein，因此仅活细胞会被染色为强绿色荧光，死细胞不能被染色。 活死细胞染色试剂盒的检测原理二、优势AbMole的Calcein-AM/PI活死细胞双染试剂盒（AbMole，M55257）具有多种优势，主要包括以下几点：快速检测：操作简单，染色过程仅需40分钟左右，
27310编辑于 2025-12-04【辰辉创聚生物】报告基因细胞系 | 信号通路分析 | 高通量药物筛选
在探索生命活动分子机制与发现新型生物活性物质的进程中，研究者需要一双能实时“看见”细胞内特定信号事件或分子互作的“眼睛”。 常见的报告基因主要包括：萤光素酶：通过催化底物（萤光素）发光进行检测，灵敏度极高，背景低，线性范围广，是高通量筛选的首选。其快速衰减的特性特别适合动态监测。荧光蛋白：如绿色荧光蛋白及其衍生物。 分泌型碱性磷酸酶：分泌到细胞培养上清中，检测方便，破坏性小，适合连续取样监测。二、核心应用：洞察通路与甄选先导化合物1. 信号通路分析这是报告基因细胞系最经典的应用。 将待测化合物库与细胞系共孵育后，通过检测报告信号的变化（如萤光素酶活性），即可高效识别出能够激活或抑制该靶点通路的“命中化合物”。 三、技术优势：灵敏、定量与高通量化相比传统的终点法检测（如Western Blot、qPCR），报告基因细胞系技术具有独特优势：实时动态与高灵敏度：特别是萤光素酶报告系统，能够检测到非常微弱的信号变化，
13910编辑于 2026-02-02- 来自专栏生信技能树
【文献】 新一代测序技术（NGS） 的十年之旅
其中荧光团标记的双碱基编码的探针（深蓝色），其由第一和第二位置中的已知核苷酸组成，然后是简并或通用碱基（粉红色）被添加到DNA文库中。 将双碱基探针连接到与接头序列（红色）互补的锚定序列（浅紫色）上，并对载玻片成像以鉴定每个片段中的前两个碱基。未延伸的链被无标记的探针或磷酸酶所覆盖，以维持循环同步。 PPi分子与ATP硫酸化酶一起将腺苷5'磷酸硫酸盐（APS）转化为ATP。反过来，ATP是荧光素酶将荧光素转化为氧化荧光素的辅助因子，副产物是荧光。 最后，腺苷三磷酸双磷酸酶用于降解任何未掺入的碱基，并将下一个碱基加入孔中。由电荷耦合器件（CCD）相机检测的每个光脉冲可确定在特定珠子处掺入一个或多个碱基。 b | Ion Torrent ? 为了使测序可视化，添加标记核苷酸的混合物;当聚合酶结合的DNA文库位于SMRT细胞的一个孔中时，聚合酶将荧光团标记的核苷酸掺入延伸的DNA链中。
3.7K40发布于 2018-08-06 - 来自专栏生物信息云
TUNEL 检测细胞凋亡(附视频)
本教材通过 TUNEL 法检测细胞凋亡， TUNEL，为原位末端转移酶标记技术。 其原理是：先增加细胞膜通透性，让 rTDT 和荧光素生物素标记的 dUTP 进入细胞内，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的辅助下将脱氧核糖核苷酸和荧光素等形成 的衍生物标记到 DNA 的 3’ 末端，从而可进行凋亡细胞的检测 如：0.2% TritonX 100， TUNEL检测试剂盒（包含 10×TdT 酶浓缩液、荧光素标记的 1×dUTP、转化剂POD），DAB 试剂盒， 3%过氧化氢甲醇，磷酸缓冲液 PBS 等。 Annixine V-FITC是一种标记有荧光素的钙依赖磷脂结合蛋白，与PS有很强的亲和力，可特异性与PS结合，凋亡早期细胞仍保持膜的完整性，碘化丙啶（PI）不能进入细胞内，坏死细胞细胞膜破裂，只能被PI 利用流式细胞仪进行双参数分析，即可将凋亡细胞和继发性坏死的细胞区分开，计算出阳性细胞百分率。并通过Western Blot检测Caspase家族的蛋白表达来判断细胞凋亡水平。
2.8K42发布于 2019-09-17 - 来自专栏生信修炼手册
文献解读|circAGFG1通过miR-195-5p调控CCNE1的表达促进三阴性乳腺癌的发展
然后通过荧光原位杂交FISH技术，定位miRNA-195-5p和circAGFG1在细胞质中，结果如下所示 ? 再通过双荧光素酶报告基因检测系统验证环状RNA和miRNA之间的结合，野生型质粒中荧光值相对下调，证明circAGFG1和miR-195-5p存在直接的相互作用。 ? 相比对照探针，在circAGFG1探针富集结果中检测到了对应的环状RNA和miRNA。 对于找到的miRNA-195-5p, 同样做了RT-PCR验证，发现在肿瘤中表达量下调，结果如下 ? 5. mRNA和miRNA相互作用分析 根据TargetScan的分析结果，CCNE1和miRNA-195-5p存在相互作用，同样通过双荧光素酶报告基因检测系统来验证，结果如下 ? ? 分析和验证的一个思路 通过RNA_seq数据分析初步确定候选的各种RNA分子 结合TGGA公共数据库的结果和自己的测序数据相互印证 对于数据分析得到的差异表达趋势，通过RT-PCR验证 对于miRNA的靶标关系，通过双荧光素酶报告基因检测系统进行验证
87920发布于 2019-12-19 - 来自专栏生信菜鸟团
基因组 | NC | KLHL17表达的等位基因效应揭示了胰腺癌全基因组关联信号在chr1p36.33处的遗传基础
◉ g rs13303160及其周围序列作为增强子连接在最小启动子及荧光素酶基因上游，在三个细胞系中进行的荧光素酶报告基因实验。◉ 对于EMSA和荧光素酶实验，风险等位基因为红色标注。 ◉ 对A/G比值相对于A/A的相对荧光素酶活性进行了非配对双尾t检验；n=6个生物学重复。 Luciferase assays 荧光素酶检测 Para_01 在转染前24小时，将MIA PaCa-2、PANC-1和HEK293T细胞接种于48孔板中。 按照制造商的说明，使用Promega双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行荧光素酶检测。 荧光素酶活性以Renilla荧光素酶活性为标准化，并表示为空载体荧光素酶对照的倍数变化。 荧光素酶活性的测定方法如上所述。 使用非配对双尾t检验对A与G相对荧光素酶活性的比值进行显著性分析。
49610编辑于 2025-06-20 抗体标记服务｜FITC/Alexa Fluor偶联｜流式细胞与ELISA应用
通过抗体偶联服务，将各类功能性标签精准地连接到抗体分子上，使得目标检测更加灵敏和特异。荧光抗体标记和酶标抗体偶联，是目前应用最为广泛的两种技术路线。 一、抗体标记服务的技术基础抗体标记服务的核心在于将荧光染料或酶标签，通过化学反应稳固偶联到抗体分子特定位置。FITC标记抗体通常通过NHS酯与抗体中赖氨酸残基的氨基共价结合，反应温和且高效。 相比之下，Alexa Fluor标记抗体因其高亮度与光稳定性，已成为多色荧光检测的首选。酶标抗体偶联以HRP标记抗体为典型代表，广泛应用于各种免疫分析实验。 生物素抗体标记利用生物素-亲和素系统，实现信号放大，极大提升了检测灵敏度。抗体染料偶联技术讲求反应条件的精确控制，以保证抗体活性不被破坏，同时避免非特异性结合。 免疫组化抗体偶联则利用酶标抗体偶联技术，如HRP标记抗体，进行组织或细胞切片中特异蛋白的染色定位。生物素抗体标记结合亲和素信号放大系统，为低丰度蛋白的检测提供了有效手段。
30510编辑于 2025-07-30- 来自专栏DrugScience
Nature | 从头设计模块化和可调的蛋白生物传感器
它应该具有以下几个性质: ①普适性：待测物引发的构象改变应该不受待测物的具体细节影响，；②可变性：可根据不同的检测物，检测需求进行调整；③灵敏性：构象改变应可转换为一个灵敏的输出。 本研究构建了一个由两种蛋白组分构成的系统：①一个“笼结构域”(cage domain) 和一个“门闩结构域”(latch domain)构成的“lucCage”；②一个可结合开启状态lucCage的“钥匙肽段”和一个荧光素酶片段构成的 在没有待测物时，门闩和笼结构域结合，lucKey无法结合从而钥匙肽段上的荧光素酶片段无法和门闩结构域上的另一个荧光素酶片段结合，从而无法产生荧光信号；当存在待测物时，待测物和门闩结构域的特异性位点结合， 释放笼结构域的结合位点，使得lucKey结合Cage, lucKey和门闩结构域的两个荧光素酶片段相结合，从而产生荧光信号。 通过调整cage打开的自由能ΔGopen和cage结合key的自由能ΔGCK的平衡，这个体系可以实现对不同待测物，不同检测条件下对待测物的灵敏检测。 ?
54130发布于 2021-02-04 - 来自专栏生信喵实验柴
pacbio测序原理
3、均匀的覆盖率：SMRT 不需要扩增过程，不受 GC 偏向影响，所有片段的覆盖率均相同； 4、可直接检测碱基上的化学修饰：在通过 DNA 聚合酶的时候，有化学修饰的碱基的通过速度较慢，这种减慢可以反应在荧光信号的间隔上 7.2 聚合酶 DNA 聚合酶活性是 Pacbio 读长长短的决定性因素： pacbio 测序聚合酶 1、在聚合酶上加上生物素，在玻璃板上加上链霉亲和素，将聚合酶固定在玻璃板的底部 ； 2、聚合酶存在于玻璃板的底部，当聚合酶抓住一个 dNTP 的时候，会停留一段时间，这时激发波长才会激发基团发出荧光，而孔中其他少量的游离 dNTP 则不会被激发； 3、对聚合酶的三个要求 其主要有两部分构成：发卡状单链接头（Hairpin Adapter）和双链 DNA模板（Double stranded DNA Template） DNA 分子被接上发卡状的 adaptor DNA 聚合酶介导的延伸反应会沿着一个方向进行，在下一个 dNTP 添加之前，前一个 dNTP上的荧光基团会从复合物上脱落下来，所以单独的一个碱基检测到的荧光信号只会持续很短的一段时间，根据检测到的不同波长和峰值以及他们之间的间隔
7.6K20编辑于 2021-12-27
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