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全长转录组 | 三代全长转录之circRNA（ONT ）-- CIRI-long
（Oxford Nanopore Technologies ，ONT）高效测定circRNA全长转录本的实验和计算方法：利用随机引物对circRNA进行的滚环反转录扩增后，使用三代纳米孔测序技术（ONT ）对circRNA的全长序列进行直接测序，并开发了CIRI-long 算法，实现对长测序读段中的circRNA序列进行识别和全长重构。 实验结果表明，与传统的circRNA二代测序技术相比，该方法将circRNA检测灵敏度提升了20倍，并可实现对不同长度（<100bp - 5kb）的circRNA全长序列的无偏识别，大幅提升了环形转录本的重构能力 赵方庆教授团队开发了一种利用三代纳米孔（ONT）测序技术进行circRNA及其相应的异构体（isoform）富集和全长测序的方案。 此方法利用了三代纳米孔测序的长读长优势，实现了对全长circRNA序列的无偏重建（图2）。
80920编辑于 2024-04-07 - 来自专栏三代测序-说
全长转录组 | 三代全长转录组分析流程（PacBio & ONT ）-- Bambu
今天我们继续介绍一款使用三代全长转录本数据进行转录本注释和定量的工具 - Bambu。 大多数转录本定量方法依赖于固定的基因参考注释文件；然而，实际情况下的转录组是动态的，需要根据当时的情境情况来判断，静态转录组注释文件包含了一些基因的非活跃转录本（isoforms)，而对于另一些基因存在注释不完整的情况 Bambu 保留了全长和独特的转录本序列，使其在存在非活跃转录本（isoforms) 的情况下能够进行准确的定量。与现有的转录本鉴定方法相比，Bambu 在不损失灵敏性的情况下实现了更高的精度。 TRUE)) install.packages("BiocManager") #如果已经安装BiocManager可忽略此行命令 BiocManager::install("bambu") 建议：因为全长转录组数据量一般较大以及计算量大 #加载bambu软件包 library(bambu) #运行以下命令进行测序数据，参考基因组，参考基因组注释文件的导入，并进行全长转录组分析 test.bam <- system.file("extdata
2.4K22编辑于 2024-03-13 - 来自专栏三代测序-说
全长转录组 | 三代全长转录组分析流程（PacBio & ONT ）-- Flair
今天我们介绍一款使用三代全长转录本数据进行转录本校正，聚类，可变剪切分析，定量和差异分析为一体的工具 - FLAIR。 Oxford Nanopore（ONT）技术平台进行全长转录组测序，并为此开发了FLAIR分析流程用于识别高可信度转录本，进行差异剪接事件和差异转录本异构体（isoform）分析。 flair align：将三代测序序列与参考基因组进行比对。flair correct：根据参考基因组注释文件对剪切位点进行校正。如果提供二代测序数据，可进一步进行纠错校正。 注释：如果对人类全长转录本进行分析，建议最好使用Heng Li推荐的人类参考基因组 GCA_000001405.15_GRCh38_no_alt_analysis_set，详细参见Heng Li的博客。 如果下机数据来自 Oxford Nanopre（ONT）平台，建议对原始数据使用Pychopper后（目的是鉴定全长转录组本），再运行FLAIR。
4.7K22编辑于 2024-04-12 - 来自专栏三代测序-说
全长转录组 | 三代全长转录组分析流程（PacBio & ONT ）-- IsoQuant
今天我们介绍一款使用三代全长转录本数据进行转录本注释和定量的工具 - IsoQuant。2023年1月2日，康奈尔大学医学院Hagen U. Tilgner团队和圣彼得堡国立大学Andrey D. 一、软件介绍 IsoQuant 是一款基于基因组的长RNA序列（全长RNA）分析软件，适用于长度长三代测序平台，比如PacBio和Oxford Nanopores. IsoQuant 能对转录本进行重构以及定性，并且具有较高的精准度和召回率。如果提供参考基因组，IsoQuant 能根据注释文件中转录本内含子和外显子的结构将长度长测序序列回贴到注释的转录本上。 ，PacBio可通过isoseq软件获得，具体参考全长转录组 | Iso-Seq 三代测序数据分析流程 (PacBio) ；ONT可通过pychopper软件获得，具体参考全长转录组 | Oxford Nanopore (ONT) 三代全长转录组分析流程 -- 数据质控和预处理。
2.7K10编辑于 2024-02-22 - 来自专栏三代测序-说
全长转录组 | Oxford Nanopore (ONT) 三代全长转录组分析流程 -- 数据质控和预处理
ONT全长转录组测序是指基于牛津纳米孔公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）三代测序平台进行的全长转录组测序。 利用三代测序平台长度长 （long-read）的特性，无需对转录本进行片段化，直接获取某一物种mRNA（或者有polyA尾的lncRNA）5'端到3'端的高质量全长转录组序列信息（图1），可准确识别可变剪接 基于ONT三代测序平台进行全长转录组测序，除了可准确鉴别上述转录本结构变异，由于现阶段测序成本和通量（相对于PacBio平台），还可实现转录本（mRNA或polyA+ lncRNA）表达水平准确定量和差异分析 三、ONT全长转录组的分析流程PacBio全长转录组有官方自己开发优化的转录本聚类软件软件和流程，IsoSeq（https://isoseq.how/）。 参考文献：Nanopore三代全长转录组ONT全长转录组测序系列一：初识篇基因结构预测新利器-ONT全长转录组Park, Eddie et al.
8.9K23编辑于 2024-02-05 - 来自专栏三代测序-说
全长转录组 | Iso-Seq 三代测序数据分析流程 (PacBio) （1）
全长转录组（Full-length transcriptome）测序和分析是基于PacBio和Oxford Nanopore三代测序平台，利用其长读长的特性，建库测序时无需对RNA进行打断，如直接获得包含 5’UTR、3’UTR、polyA尾的mRNA全长序列及完整结构信息，从而准确分析有参考基因组物种的可变剪接及融合基因等结构信息，克服无参考基因组物种转录本拼接组装较短、信息不完整的难题 （图1）。 最早PacBio关于全长转录组的产品命名为Iso-Seq, 全称叫做 Isoform-Sequencing, 是对自家开发的转录本测序技术的规范化命名。 三代测序的特点就是读长很长，可以达到十几kb, 对于短的插入片段而言，CCS这样定义当然没有问题，但是对于全长转录本而言，转录本长度很长，比如转录本长度1kb, 读长3kb, 此时在一个零模波导孔（ZMW 参考文献Iso-seq 必备基础-blog.csdnpacbio 三代全长转录组数据分析流程PacBio Iso-Seq Workshop Online
17.1K21编辑于 2024-01-23 - 来自专栏天意生信俱乐部
三代测序100问（8）| 三代全长转录本该如何鉴定？
在上一期《三代测序100问》中，我们深入探讨了三代长读长测序如何凭借其覆盖全长mRNA的独特优势，将转录组学研究的分辨率从基因水平提升至转录本（Isoform）水平。 全长转录本的分子标记：引物与Poly(A)尾 李老师首先回顾了全长转录组测序的建库基础：“无论是PacBio的Iso-Seq，还是ONT的cDNA-PCR建库流程，其核心都是利用真核生物成熟mRNA特有的 正是这些独特的分子标记——两端的引物序列和末端的poly(A)尾——成为了我们鉴定全长转录本的关键“身份证”。通过识别并利用这些特征，我们才能有效地筛选出完整的、高质量的全长转录本序列。 工具，通过识别序列双端引物以及poly(A)尾序列来鉴定和提取全长转录本。” 这一点在实际操作中极易被忽视，却直接影响到全长信息的获取。 全长鉴定的意义：为后续分析奠基 “在我们获得真正意义上的全长序列后，就可以放心地进行下一步的转录本参考基因组比对和表达定量了。”
38300编辑于 2025-07-04 - 来自专栏三代测序-说
全长转录组 | Iso-Seq 三代测序数据分析流程 (PacBio) （2） -- pigeon
Isoseq 数据分析第一部分我们最后使用了isoseq cluster 获得了聚类后高质量的转录本，但是我们仍然不知道这些经过聚类的转录本在基因组的位置以及属于哪些基因？ 下面我们通过使用isoseq collapse和 pigeon对转录本（isoforms）进行在参考基因组指导下的进一步合并（collapse），注释，分类和定量。 一、Iso-Seq Collapse 在isoseq cluster完成以后，我们首先需要将高质量全长isoforms回贴到参考基因组上，然后进行isoseq collapse。 单个样本数据示例 pbmm2回贴转录本，map reads using pbmm2 # 建立参考基因组文件夹，并将参考基因组和注释文件放入其中 $ mkdir human_ref #参考序列建立索引 $ ，包含了用于将全长转录本isoforms按照参考基因组注释进行分类和过滤的工具。
3.2K11编辑于 2024-01-26 - 来自专栏三代测序-说
全长转录组 | PacBio 全长转录组测序的时代是否已经来了？ Kinnex full-length RNA Kit测评
至此，PacBio和ONT两大三代测序平台推动三代全长转录组进入了快速发展的时期。逐渐降低的测序价格，以及对转录本层面精细挖掘的需求，最终会使三代全长转录组测序逐步替代传统的二代RNA-seq。 全长转录组 | Iso-Seq 三代测序数据分析流程 (PacBio) （3）-- SQANTI3 v5.2 全长转录组 | 三代全长转录组分析流程（PacBio & ONT ）-- IsoQuant 其它测序厂商，如青岛百迈客，武汉希望组等都还未发布其PacBio Kinnex全长转录组得产品（截止2024年4月2日）。 诺禾致源官方公众号：新品发布 | Kinnex HiFi全长转录组革新揭幕转录组科研新章！ 安诺基因官方公众号：PacBio Kinnex全长转录组技术“靓相”科研圈，实测混样数据大公开 贝瑞基因Kinnex全长转录组解决方案
2.7K31编辑于 2024-04-02 - 来自专栏天意生信俱乐部
三代测序100问（7）：如何用三代测序技术解析全长转录本（Isoform）？
在过去的系列文章中，我们从平台选择、数据质控等“硬件”层面深入探讨了三代测序的诸多细节。今天，我们将视角转向三代测序的应用领域——全长转录组测序。 今天，我们就继续跟随山东第一医科大学李冕博士的步伐，一同探索三代测序是如何在转录组学研究中大放异彩，特别是如何精准解析全长转录本（Isoform），从而将我们的研究分辨率提升到一个全新的维度。 三代全长转录组的优势： 三代测序技术，凭借其数千乃至数万碱基的超长读长，能够轻松地一次性完整读取整个mRNA分子的序列，从5’端到3’端，无需拼接。 大家可能会好奇，三代测序是如何特异性地捕获这些全长转录本的呢？ 结语：在转录本水平挖掘新的调控机制 三代全长转录组测序技术，为我们提供了一个前所未有的强大工具，去探索可变剪接、可变多聚腺苷酸化（APA）、融合基因以及等位基因特异性表达等复杂的转录调控事件。
65300编辑于 2025-06-28 - 来自专栏用户7627119的专栏
三代测序与单细胞转录组
单细胞转录组测序通常是基于二代测序平台，具有相对较低的成本和高通量的优势。由于二代测序建库过程需要对cDNA进行打断，无法同时获得细胞标签和全长转录组数据，所以对单细胞转录本的变化知之甚少。 而三代测序可以获得全长转录组数据，对于挖掘新转录本以及isoform有着重要的意义。 三代测序是指单分子测序技术，在测序过程中，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。 三代测序与单细胞转录组结合会解决二代测序转录组读长较短和无法获取全长转录本数据的局限性，可以将单细胞水平的研究变得更加“精细”。 作者通过HIT-scISOseq构建了4000个正常和8000个受伤的猕猴角膜上皮细胞的全长转录组图谱，找到了新的异构体，并确定了与损伤相关的转录本剪切和转换机制。 展望 三代检测的全长转录本有着比二代测序更多的应用场景：检测isoform在不同细胞中的差异；区分每个基因的所有不同可变剪接产物；检测全长转录本的SNV；发现更多转录本融合情况；检测全长BCR和TCR序列等
2.2K10编辑于 2022-09-21 - 来自专栏三代测序-说
全长转录组 | Iso-Seq 三代测序数据分析流程 (PacBio) （3）-- SQANTI3 v5.2
使用三代长度长测序进行全长转录组高通量测序为数千种新转录本的发现铺平了道路，甚至在注释良好的哺乳动物物种中亦是如此；也为深入转录本水平表征基因的变化提供了强有力的技术手段。 isoform水平上进行生物信息学分析的流程，旨在提供一个全长转录组end-to-end的解决方案 （图1）。 因此，对全长转录组进行校正是进行FIT分析的前提，且对产生可靠的、在生物学上合理的结论/假设至关重要。 该模块意在保持转录组的多样性，即防止失去那些有可信junction chains的转录本。 质量控制和过滤：我们强烈建议用户尽可能仔细地检查他们的长读序列定义转录组，包括筛选转录组以移除可能的假阳性isoform，这在由长读序列生成的转录组中很常见。
4K11编辑于 2024-01-28 - 来自专栏生信喵实验柴
RNAseq不同测序平台比较
全长转录组（Iso-Seq）是指利用三代单分子实时测序技术（SMRT），无需对RNA 进行打断和拼接，即可直接获得完整的全长转录本。 今天我们就来探讨全长转录组在分析可变 polyA 方面的优势。 目前全长转录组主要应用在以下三个方面： 1、可变 polyA 检测 三代长读长技术的 Iso-Seq 技术，由于利用 OligodT 引物合成 cDNA，poly(A)会出现在测序结果中， APA 的四种类型 2、可变剪切分析 基于单分子实时测序技术（SMRT）的三代全长转录组，具有读长超长的优势，可以直接获取 mRNA 全长，因此可轻松判断 TSS 和 TTS 的位置、剪接位点的位置 可变剪切类型 注：ES：外显子跳跃、A3SS：3’端可变剪切、A5SS：5’端可变剪切、MEX：外显子选择性跳跃，IR：内含子保留 3、融合基因检测 三代全长转录组技术无需对
3.9K20编辑于 2022-10-25 - 来自专栏天意生信俱乐部
三代测序100问（11）| 有一键进行三代全长转本的组装和定量的分析工具吗？
在上一期《三代测序100问》中，我们详细探讨了经典工具StringTie如何在三代全长转录组分析中大展身手，特别是结合Minimap2进行比对后的组装和定量。 今天，我们就来介绍一款这样的“利器”，它以高效和用户友好著称，为三代全长转录组分析注入了更多便利。 更值得一提的是，IsoQuant兼容PacBio和ONT平台的原始数据，这使其在三代转录组研究中脱颖而出。 去年，两篇高影响力文章——一篇发表于《Nature Communications》，另一篇发表于《Nature Methods》——均对全长转录组定性和定量工具进行了全面评测。 结语：高效工具赋能科研 总之，IsoQuant以其一键操作的便捷性和顶尖的性能，为三代全长转录组分析提供了理想解决方案。它不仅简化了从比对到定量的全流程，还在权威评测中证明了其卓越价值。
29210编辑于 2025-09-30 - 来自专栏三代测序-说
全长转录组 | ONT Direct RNA测序 (DRS) 技术原理、数据分析和应用
因此，基于三代长读长测序平台的全长转录组成为新的研究热潮。 全长转录组（Full-length transcriptome）是基于 PacBio（Pacific Biosciences） 或 ONT（Oxford Nanopore Technologies） 三代测序平台 在全长转录组基础之上，ONT - 三代测序平台的直接RNA测序（Direct RNA-seq），相对于传统的 反转录cDNA - PCR扩增（二代和三代RNA-seq测序都有相应的建库方案）流程，其能够保留并检测天然 PacBio Iso-Seq， 基于PacBio三代测序平台的mRNA Iso-Seq建库测序流程能够检测长达15 kb的全长转录本序列，有助于发现大量先前未注释到的转录本，并可通过全长序列确认早期基于跨物种同源序列的基因预测结果 ONT cDNA-PCR，基于ONT三代测序平台的cDNA-PCR建库测序流程也可以检测全长转录本，而且适用于单细胞全长转录组测序。同样使用模板置换反转录，PCR扩增来制备全长转录本文库（图5）。
4.8K22编辑于 2025-07-17 - 来自专栏天意生信俱乐部
三代测序100问（10）| Stringtie能用于三代全长转本的组装和定量吗？
然而，随着三代长读长测序技术的兴起，一个新的疑问摆在了我们面前：这个为短读长数据而生的经典工具，能否适应长读长、高复杂度的全长转录本数据呢？ 正如李老师最近被问到的：“二代RNA-seq的经典工具StringTie，能否用于三代全长转录组的定量（有参模式）？” 今天，我们就围绕这个问题，深入探讨StringTie在长读长时代如何焕发新生。 StringTie的演进：从短读长到长读长的华丽升级 答案是肯定的：StringTie完全可以用于三代全长转录本的组装和定量，并且表现出色。 StringTie在三代全长转录本分析中的实战流程 既然StringTie的表现如此优秀，那么在实际操作中，我们该如何将其应用于三代全长转录本的组装和定量呢？ 快去尝试一下StringTie的长读长模式，解锁您转录组数据的更多潜力吧！我们下期见！
37010编辑于 2025-08-01 - 来自专栏生信技能树
长读长单分子实时测序揭示食管鳞状细胞转录组的异质性和复杂性
通过Realtime PCR和Sanger测序验证了两个新的融合转录本。总体来说，长读长单分子测序很大程度上拓宽了对食管细胞全长转录组的认识，并对癌变过程中的转录多样性提供了新的认识。 为什么使用三代测序？ PacBio单分子实时(SMRT)平台属于三代测序平台，能够对几千个碱基对的长圆形共识序列进行测序，并有机会捕获全长转录本。 融合转录本的验证和测序 实时PCR和Sanger测序 研究结果 1. 食管细胞的全长转录组测序结果 SMRT数据集质量良好 ? ? 2. 食管细胞中全长转录本特征 2.1 从全长转录本中发现的新基因和异构体 使用GMAP将SMRT reads比对人类Ensembl 38 release 91基因组。 TSS与三个表观基因组标记物的距离更近，大部分的平均距离为1 bp，证明了全长转录的有效性。 ?
95430发布于 2020-09-22 - 来自专栏天意生信俱乐部
三代测序100问（3）：谁是你的天选三代测序商业服务商？
临床检测与人类全基因组： 对于三代测序在遗传病诊断、肿瘤研究以及大规模人群队列的人类全基因组重测序等临床转化应用，以基因诊断技术见长的贝瑞和康，凭借其在临床领域的积累，是一个值得考虑的选项。 敬请期待《三代测序100问》的后续精彩！ 从平台选择到深度解析：开启您的全长转录组研究新篇章！ 明智地选择了商业服务提供商，您已为揭示转录本的完整图景奠定了基础。 然而，真正的挑战往往在于如何驾驭这些信息丰富的长读长数据，将其转化为深刻的生物学洞见——特别是在复杂精妙的全长转录组分析领域。 面对数据处理的种种难点，从繁琐的流程到结果的精准解读，李博士将其多年实战精华，浓缩于一门专为攻克《三代全长转录组测序数据分析》难题而设的精品课程中。 渴望将您的长读长转录组数据转化为激动人心的发现吗？
28200编辑于 2025-05-10 - 来自专栏天意生信俱乐部
跨越短读长局限：三代长读长测序在科研与临床的未来五年机遇
精确的转录本异构体（Isoform）鉴定： 无需拼接即可获得全长转录本序列，精准识别可变剪切、融合基因等，极大提升转录组研究的深度和准确性。 基因组/表观遗传修饰 转录组/表观遗传修饰 长读长测序的独特优势正在重塑多个研究领域 遗传病研究：人类基因组中相当一部分致病变异是结构变异，这正是NGS的短板。 三代测序在遗传病研究中的应用优势 转录组学研究：TGS的全长转录本测序（Iso-Seq）技术，无需依赖计算组装，即可精确描绘转录本的多样性，包括可变剪切异构体、融合基因、等位基因特异性表达等。 三代测序在转录组中的应用优势 微生物组学研究：TGS能够获得全长的16S/18S/ITS rRNA基因序列，显著提升物种（甚至菌株）水平的分类精度。 在人工智能（AI）赋能的多组学研究和个体化精准医疗的大背景下，能够提供更完整、更全面基因组和转录组信息的长读长测序技术，其战略地位日益凸显。
79510编辑于 2025-04-02 - 来自专栏生信技能树
fast5和fastq格式
前面我们介绍了Oxford Nanopore Technologies（牛津纳米孔技术）公司的一些测序仪，也看到了它产出的测序数据，详见:全长转录组分析之牛津纳米孔测序介绍 现在前面一起来详细认识这样的数据吧 混样主要是需要凑够样本数达到一个上机lane的测序量，目前三代全长转录组一个样本基本产出2G就可以满足下游分析，因此，多属于混样建库测序。 对于一次下机的数据，文件如下： ? fastq：由fast5文件转换而来，以.fastq或.fq结尾，与二代格式一样，四行为一个单位，只不过序列要长很多，这是三代的一个优势。 ? sequance_summary 此次专题主要学习和记录一些在分析ONT测序产品如ONT全长转录组，ONT甲基化以及ONT重测序中的所思所想所得。 个人所知有限，如有理解错误，还请批评指正。
1.8K20发布于 2020-04-14
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