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全长转录组 | 三代全长转录组分析流程（PacBio & ONT ）-- Bambu
今天我们继续介绍一款使用三代全长转录本数据进行转录本注释和定量的工具 - Bambu。 Bambu 保留了全长和独特的转录本序列，使其在存在非活跃转录本（isoforms) 的情况下能够进行准确的定量。与现有的转录本鉴定方法相比，Bambu 在不损失灵敏性的情况下实现了更高的精度。 #加载bambu软件包 library(bambu) #运行以下命令进行测序数据，参考基因组，参考基因组注释文件的导入，并进行全长转录组分析 test.bam <- system.file("extdata #根据三代测序平台和建库方法选择合适的运行命令，一步法 $ minimap2 -ax splice:hq -uf ref.fa iso-seq.fq | samtools sort -@ 12 -o align.bam assays(se)$fullLengthCounts - 每个转录本的全长序列count表达量。 assays(se)$uniqueCounts - 每个转录本唯一回贴序列的count表达量。
2.3K22编辑于 2024-03-13 - 来自专栏三代测序-说
全长转录组 | 三代全长转录组分析流程（PacBio & ONT ）-- Flair
今天我们介绍一款使用三代全长转录本数据进行转录本校正，聚类，可变剪切分析，定量和差异分析为一体的工具 - FLAIR。 FLAIR通过算法设计能够从三代ONT数据中识别微小的剪切变化。 三代测序数据：reads.fq 或 reads.fa。 第一步提供的三代测序数据：reads.fq 或 reads.fa。。 #支持序列必须都是全长（80%的覆盖率，第一个和最后一个外显子至少有25个碱基）。
4.6K22编辑于 2024-04-12 - 来自专栏三代测序-说
微生物全长16S | Full-length 16S Analysis -- PacBio Hifi Reads
微生物研究新世代 -- 三代全长16S （Full-length 16S） 时至今日，微生物群落研究已全面进入测序分析阶段，当前研究主流处于二代扩增子与三代扩增子交接的时段。 三代16S扩增子测序，采用27F、1492R引物扩增全长片段（覆盖V1-V9区），则能够轻松覆盖16S总长约1500bp共9个可变区，最大程度保留了物种鉴定的可能性（图3）。 有了如此高的分辨率表现，菌种级别的研究自然成为了研究重点，不同于过往对于二代16S科、属水平的研究，三代全长16S能够提供更全面且细致的菌株级别分析结果，让整个研究结果更贴近生态学功能，对于多组学关联以及后续课题实验指导 四、PacBio三代全长16S分析流程 前提是需要安装SMRTlink。 1. 下载 Sequel II 16S barcode序列文件。 三代全长16s — 望向微生物世界的尽头。 Matsuo, Y., Komiya, S., Yasumizu, Y. et al.
5.6K20编辑于 2024-02-09 - 来自专栏三代测序-说
全长转录组 | 三代全长转录之circRNA（ONT ）-- CIRI-long
因此，确定其的全长序列，是进行circRNA功能研究的重要基础。 （Oxford Nanopore Technologies ，ONT）高效测定circRNA全长转录本的实验和计算方法：利用随机引物对circRNA进行的滚环反转录扩增后，使用三代纳米孔测序技术（ONT ）对circRNA的全长序列进行直接测序，并开发了CIRI-long 算法，实现对长测序读段中的circRNA序列进行识别和全长重构。 赵方庆教授团队开发了一种利用三代纳米孔（ONT）测序技术进行circRNA及其相应的异构体（isoform）富集和全长测序的方案。 此方法利用了三代纳米孔测序的长读长优势，实现了对全长circRNA序列的无偏重建（图2）。
74520编辑于 2024-04-07 - 来自专栏三代测序-说
全长转录组 | 三代全长转录组分析流程（PacBio & ONT ）-- IsoQuant
今天我们介绍一款使用三代全长转录本数据进行转录本注释和定量的工具 - IsoQuant。2023年1月2日，康奈尔大学医学院Hagen U. Tilgner团队和圣彼得堡国立大学Andrey D. 一、软件介绍 IsoQuant 是一款基于基因组的长RNA序列（全长RNA）分析软件，适用于长度长三代测序平台，比如PacBio和Oxford Nanopores. 通过yaml文件指定输入文件： 指定输入三代数据文件路径，名称和不同实验（批次），匹配的二代测序数据；可以通过编辑一个YAML文件，使用--yaml命令，例如： [ data format: "fastq ，PacBio可通过isoseq软件获得，具体参考全长转录组 | Iso-Seq 三代测序数据分析流程 (PacBio) ；ONT可通过pychopper软件获得，具体参考全长转录组 | Oxford Nanopore (ONT) 三代全长转录组分析流程 -- 数据质控和预处理。
2.7K10编辑于 2024-02-22 - 来自专栏天意生信俱乐部
三代测序100问（8）| 三代全长转录本该如何鉴定？
在上一期《三代测序100问》中，我们深入探讨了三代长读长测序如何凭借其覆盖全长mRNA的独特优势，将转录组学研究的分辨率从基因水平提升至转录本（Isoform）水平。 全长转录本的分子标记：引物与Poly(A)尾 李老师首先回顾了全长转录组测序的建库基础：“无论是PacBio的Iso-Seq，还是ONT的cDNA-PCR建库流程，其核心都是利用真核生物成熟mRNA特有的 正是这些独特的分子标记——两端的引物序列和末端的poly(A)尾——成为了我们鉴定全长转录本的关键“身份证”。通过识别并利用这些特征，我们才能有效地筛选出完整的、高质量的全长转录本序列。 李老师着重指出，“在对ONT原始数据进行质控时，务必保留其双端引物序列，否则pychopper将无法识别全长转录本。有些同学在质控阶段就把引物过滤掉了，导致后续无法进行全长鉴定。” 这一点在实际操作中极易被忽视，却直接影响到全长信息的获取。 全长鉴定的意义：为后续分析奠基 “在我们获得真正意义上的全长序列后，就可以放心地进行下一步的转录本参考基因组比对和表达定量了。”
35300编辑于 2025-07-04 - 来自专栏三代测序-说
全长转录组 | PacBio 全长转录组测序的时代是否已经来了？ Kinnex full-length RNA Kit测评
至此，PacBio和ONT两大三代测序平台推动三代全长转录组进入了快速发展的时期。逐渐降低的测序价格，以及对转录本层面精细挖掘的需求，最终会使三代全长转录组测序逐步替代传统的二代RNA-seq。 每个连接杆可以和数十种不同的构件相连，依此循环，无限延伸，因为 Kinnex 系列建库试剂盒将多个转录本或全长16S rRNA串联以提高通量的原理类似于 K'NEX，所以起名为 Kinnex 。 但是像细菌16S项目，全长的16S也只有1.5kb，或者转录本长度（单个转录本的平均长度为100bp-5kb）短于文库大小，使用标准Full-length 16S rRNA 或 Iso-Seq方案对单个环化互补 Kinnex建库试剂盒搭配Revio全新芯片，极大的提高了对全场16S rRNA和转录本的测序通量，使得对于大多数用户在成本在可接受范围内对微生物和转录本定量成为了可能。 全长转录组 | Iso-Seq 三代测序数据分析流程 (PacBio) （3）-- SQANTI3 v5.2 全长转录组 | 三代全长转录组分析流程（PacBio & ONT ）-- IsoQuant
2.6K31编辑于 2024-04-02 - 来自专栏三代测序-说
全长转录组 | Oxford Nanopore (ONT) 三代全长转录组分析流程 -- 数据质控和预处理
ONT全长转录组测序是指基于牛津纳米孔公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）三代测序平台进行的全长转录组测序。 利用三代测序平台长度长 （long-read）的特性，无需对转录本进行片段化，直接获取某一物种mRNA（或者有polyA尾的lncRNA）5'端到3'端的高质量全长转录组序列信息（图1），可准确识别可变剪接 基于ONT三代测序平台进行全长转录组测序，除了可准确鉴别上述转录本结构变异，由于现阶段测序成本和通量（相对于PacBio平台），还可实现转录本（mRNA或polyA+ lncRNA）表达水平准确定量和差异分析 一、ONT测序技术简介ONT测序是基于电信号识别碱基序列的三代测序技术。 参考文献：Nanopore三代全长转录组ONT全长转录组测序系列一：初识篇基因结构预测新利器-ONT全长转录组Park, Eddie et al.
8.7K23编辑于 2024-02-05 - 来自专栏天意生信俱乐部
三代测序100问（7）：如何用三代测序技术解析全长转录本（Isoform）？
在过去的系列文章中，我们从平台选择、数据质控等“硬件”层面深入探讨了三代测序的诸多细节。今天，我们将视角转向三代测序的应用领域——全长转录组测序。 今天，我们就继续跟随山东第一医科大学李冕博士的步伐，一同探索三代测序是如何在转录组学研究中大放异彩，特别是如何精准解析全长转录本（Isoform），从而将我们的研究分辨率提升到一个全新的维度。 三代全长转录组的优势： 三代测序技术，凭借其数千乃至数万碱基的超长读长，能够轻松地一次性完整读取整个mRNA分子的序列，从5’端到3’端，无需拼接。 技术原理浅析：如何捕获全长mRNA？ 大家可能会好奇，三代测序是如何特异性地捕获这些全长转录本的呢？ 结语：在转录本水平挖掘新的调控机制 三代全长转录组测序技术，为我们提供了一个前所未有的强大工具，去探索可变剪接、可变多聚腺苷酸化（APA）、融合基因以及等位基因特异性表达等复杂的转录调控事件。
61600编辑于 2025-06-28 - 来自专栏天意生信俱乐部
三代测序100问（10）| Stringtie能用于三代全长转本的组装和定量吗？
然而，随着三代长读长测序技术的兴起，一个新的疑问摆在了我们面前：这个为短读长数据而生的经典工具，能否适应长读长、高复杂度的全长转录本数据呢？ 正如李老师最近被问到的：“二代RNA-seq的经典工具StringTie，能否用于三代全长转录组的定量（有参模式）？” 今天，我们就围绕这个问题，深入探讨StringTie在长读长时代如何焕发新生。 StringTie的演进：从短读长到长读长的华丽升级 答案是肯定的：StringTie完全可以用于三代全长转录本的组装和定量，并且表现出色。 StringTie在三代全长转录本分析中的实战流程 既然StringTie的表现如此优秀，那么在实际操作中，我们该如何将其应用于三代全长转录本的组装和定量呢？ 对于初次进行全长转录组分析的同学，直接使用Minimap2比对后，结合StringTie的长读长模式进行组装和定量，无疑是一个高效且可靠的选择。 好了，本期节目就到这里。
35010编辑于 2025-08-01 - 来自专栏科技记者
使用纳米孔测序数据进行16S-DNA条形码研究的计算方法[综述]
（c）第三代测序（纳米孔）。这种最近开发的方法开始于使用通用引物从环境DNA扩增全长16S rRNA基因。 推荐的MinION 16S rRNA扩增子管线用于细菌多样性分析。 2 第三代测序技术 近年来，已经开发了第三代测序（TSG）技术，并已与前一种测序策略并行和互补地使用。 ONT平台会产生长读长，从而可以通过快速，廉价和高通量的过程覆盖16S rRNA基因的全长序列（V1-V9区）。 全长16S rRNA序列最相关的优势之一是，由于在分析中考虑了16S rRNA基因的所有信息位点，因此它们为细菌鉴定提供了更高的分类学和系统发育分辨率。 使用Nanopore，可以使用通用引物（27F和1493R）通过PCR扩增全长16S rRNA基因。
1.6K31发布于 2020-04-14 - 来自专栏天意生信俱乐部
三代测序100问（20）：对于三代测序平台，有哪些靶向捕获策略？
三代测序技术以其直接读取长片段DNA或RNA的能力，在基因组从头组装和全长转录组分析等领域展现出无与伦比的优势。然而，在许多研究场景中，我们的兴趣并非遍布整个基因组，而是聚焦于特定的基因或功能区域。 一个典型的应用便是利用通用引物对细菌的16S rRNA基因全长进行扩增，用于菌群分类研究。 优缺点分析： 优势： 灵敏度极高，能够从极微量的样本中富集目标；成本相对低廉；操作流程简单快捷。 适用场景： 更适合小规模目标区域（如少数几个基因或外显子）的富集，或微生物菌群的16S/18S/ITS等扩增子测序。 如果判断这条序列不属于预设的目标区域，系统会立即施加一个反向电压，将其“弹出”纳米孔；而目标片段则被允许继续通过，完成全长测序。 希望这份梳理能帮助您在启动三代靶向测序项目时，做出最明智的决策。我们下期再见！
26110编辑于 2025-11-20 - 来自专栏三代测序-说
全长转录组 | Iso-Seq 三代测序数据分析流程 (PacBio) （1）
全长转录组（Full-length transcriptome）测序和分析是基于PacBio和Oxford Nanopore三代测序平台，利用其长读长的特性，建库测序时无需对RNA进行打断，如直接获得包含 Iso-seq基础概念 （1）ROI：reads of insertROI , 全称 reads of insert，可以理解为插入片段，首先看下三代测序文库构建阶段的reads示意图，如图3：对于上述的文库片段 三代测序的特点就是读长很长，可以达到十几kb, 对于短的插入片段而言，CCS这样定义当然没有问题，但是对于全长转录本而言，转录本长度很长，比如转录本长度1kb, 读长3kb, 此时在一个零模波导孔（ZMW clean reads 就已经是转录本的序列了，我们首先看一下clean reads 当中，哪些是全长转录本；哪些不是全长转录本。 参考文献Iso-seq 必备基础-blog.csdnpacbio 三代全长转录组数据分析流程PacBio Iso-Seq Workshop Online
16.8K21编辑于 2024-01-23 - 来自专栏生信喵实验柴
宏基因组建库测序
PRJEB30781/P10.fastq.gz P10.filter.fq.gz 三、不同测序平台比较 宏基因组测序同样需要考虑不同测序平台的影响，目前主要有二代测序 illumina，华大DNBseq，三代 不同测序平台比较 平台 二代测序 Pacbio Nanopore 优点 1、数据量大2、价格便宜3、测序丰度高，可以鉴定低丰度微生物 1、可以得到 16S 全长序列；2、准确性高，鉴定准确 1、可以进行实时测序 ，方便进行快速鉴定2、可以得到 16S 全长；3、宏基因组进行拼接效果较好； 缺点 1、读长短，唯一性差2、测序速度慢，不能进行快速鉴定；3、16S 测序无法得到全长；4、不便于宏基因组拼接； 1、价格高 2、数据量低，不能进行定量鉴定3、无法实时测序，进行快速鉴定 1、价格贵2、错误率高3、16S 序列错误率较高 写在最后：有时间我们会努力更新的。
1.3K10编辑于 2023-02-24 - 来自专栏生信菜鸟团
AutoTax | 基于全长 16S 测序数据创建特定环境的菌群注释数据库
16S rRNA 扩增子测序是研究微生物群落多样性和动态变化的重要方法。 然而，目前公共 16S rRNA 参考数据库中仍缺乏许多环境微生物的高同一性参考序列，也缺乏针对大多数未培养微生物的系统分类注释。 随着高通量全长 16S rRNA 基因测序方法的发展，我们可以快速生成覆盖真实多样性的高分类水平的 16s 全长数据库。然而，单靠提高序列覆盖率并不能解决许多未培养分类群的分类注释不佳的问题。 这也意味着用于生成注释数据库的全长 16S rRNA 频率可用作特定生态系统的系统发育信息权重（参见 qiime2 q2-clawback 插件）。 AutoTax 注释框架 ? AutoTax 程序的详细说明 生成全长 16S rRNA ASV 全长 16S rRNA 基因序列首先根据 SILVA 138 SSURef Nr99 数据库 使用 usearch -orient 命令固定序列方向
2.6K21发布于 2021-07-05 - 来自专栏天意生信俱乐部
三代测序100问（11）| 有一键进行三代全长转本的组装和定量的分析工具吗？
在上一期《三代测序100问》中，我们详细探讨了经典工具StringTie如何在三代全长转录组分析中大展身手，特别是结合Minimap2进行比对后的组装和定量。 今天，我们就来介绍一款这样的“利器”，它以高效和用户友好著称，为三代全长转录组分析注入了更多便利。 更值得一提的是，IsoQuant兼容PacBio和ONT平台的原始数据，这使其在三代转录组研究中脱颖而出。 因此，在数据质控阶段，务必避免裁切掉Poly(A)尾序列，以确保工具能正确识别和处理全长信息。这一细节虽小，却直接影响分析的完整性。 结语：高效工具赋能科研 总之，IsoQuant以其一键操作的便捷性和顶尖的性能，为三代全长转录组分析提供了理想解决方案。它不仅简化了从比对到定量的全流程，还在权威评测中证明了其卓越价值。
26710编辑于 2025-09-30 - 来自专栏三代测序-说
全长转录组 | Iso-Seq 三代测序数据分析流程 (PacBio) （2） -- pigeon
一、Iso-Seq Collapse 在isoseq cluster完成以后，我们首先需要将高质量全长isoforms回贴到参考基因组上，然后进行isoseq collapse。 do-not-collapse-extra-5exons UHRR.mapped.bam UHRR.flnc.bam UHRR.collapsed.gff 二、Pigeon使用方法 Pigeon是一个PacBio转录工具包，包含了用于将全长转录本
3.2K11编辑于 2024-01-26 - 来自专栏科技记者
SMURF-Science封面文章使用的16S新流程
首先是研究手段，并不是宏基因组，是16S，估计是由于肿瘤中的微生物含量过少，多数不能满足宏基因组的建库所需DNA的量。 然后，作者是用了一种不同于常规16S的研究手段进行的，扩增并测序了5段V区（68%的长度），然后合并分析的，作者称之为SMURF的方法流程，认为这个方法是接近于三代16S全长的物种分辨率的，并给出了参考文献 鉴于三代测序的成本居高不下，这个方法还是有一定市场的，二代的白菜价格，获得三代的结果，何乐而不为呢？有这么好的学习资源，我们当然要学习一下嘛。 base_samples_dir = '/'; ... % ********************** SAMPLE PREP PARAMETERS ******************** % Set the 16S
99531发布于 2021-02-15 - 来自专栏天意生信俱乐部
跨越短读长局限：三代长读长测序在科研与临床的未来五年机遇
精确的转录本异构体（Isoform）鉴定： 无需拼接即可获得全长转录本序列，精准识别可变剪切、融合基因等，极大提升转录组研究的深度和准确性。 三代测序在遗传病研究中的应用优势 转录组学研究：TGS的全长转录本测序（Iso-Seq）技术，无需依赖计算组装，即可精确描绘转录本的多样性，包括可变剪切异构体、融合基因、等位基因特异性表达等。 三代测序在转录组中的应用优势 微生物组学研究：TGS能够获得全长的16S/18S/ITS rRNA基因序列，显著提升物种（甚至菌株）水平的分类精度。 为了帮助大家更好地把握这一技术浪潮，弥合理论与实践之间的鸿沟，天意生信云联合三代测序说特别策划并推出了一系列关于三代测序技术的全方位实战培训内容。 该课程由山东第一医科大学博士，三代测序技术先行者--李冕老师主讲。旨在帮助学员系统地学习和掌握三代测序技术。
74110编辑于 2025-04-02 - 来自专栏Listenlii的生物信息笔记
NC：MiDAS4 全球污水处理厂16S rRNA全长基因序列数据库
MiDAS4收集了740个污水处理厂超过5百万条高质量16S全长序列。对污水处理厂细菌的注释效果更好。 图4 两对16S引物的比较。V1–V3分类学分辨率最高；V4虽然系统发育信号较弱，但理论覆盖度高。结果两者在一些类群上的丰度存在很大的差异。 图5 影响群落的环境和生物地理因素。
78350编辑于 2022-05-18
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