链子特定的礼帽/袖扣

Question

我有一个特定于链的RNA-seq文库要组装(Illumina)。我想用礼帽/袖扣。从TopHat的手册上，它说，

“--库类型TopHat将读取视为特定于链。每个读取对齐都将具有XS属性标记。请考虑在下面提供库类型选项以选择正确的RNA-seq协议。”

这是否意味着TopHat只支持特定于链的协议？我使用选项"--library-type fr-unstranded“来运行，这是否意味着它以特定于strand的方式运行？我在谷歌上搜索并询问了开发人员，但没有得到任何答案...

我得到了一些结果：

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在这里，重叠群由两组读取组装而成，左侧为反向读取，右侧为正向读取。(为了可视化，我有反向补充正确的伙伴)

但有些重叠群完全是从反向或正向读取组装而来的。如果它是链特异性的，一个基因应该在相同的方向上产生读数。它不应该像上图那样报告结果，我说的对吗？或者，有没有可能一个基因是片段化的，然后独立测序，所以偶然的是左边部分产生反向阅读，而右边部分产生正向阅读？根据我的理解，链的特异性是通过3'/5‘连接来保持的，所以应该以基因为单位。

这里的问题是什么？还是我错误地理解了“链特异性”的概念？任何帮助都是非常感谢的。

Answer 1

顶帽/袖扣不是用来组装的，它们是用来与已经组装的基因组或转录组进行比对的。您将您的阅读内容与哪些内容对齐？另外，如果你有特定于链的数据，你不应该选择无链的库类型。您应该根据您的库准备方法选择合适的库。如果选择无链接库类型，则XS标签将仅放置在拆分读取上。

Answer 2

如果你想重新组装你的转录组，你应该看一看组装器(而不是映射器)，比如

• Trinity
• SoapDeNovo
• Oases....

Answer 3

Tophat既可以处理搁浅的库，也可以处理未搁置的库。在您的快照中，中心区域确实同时具有+和-链读取。两端的偏差可能是你的库准备或分析方法的一些特征。这个基因的方向是什么？它看起来有点偏向左边。如果左边对应于3‘末端，那么很可能你的文库准备有3’偏置特征(例如，dT-primed反转录)，你的RNA片段的方式也可能对你的阅读分布产生影响。我想我们需要更多的信息来找出真相。但我们也应该记住，礼帽/袖扣也可能有bug。