PEI转染流程避坑！293T、Expi293F与CHO-S的PEI瞬转优化

摘要：PEI瞬时转染广泛应用于重组蛋白、抗体及基因递送相关颗粒的体外表达，但不同宿主细胞在生长方式、核酸摄取能力、转染耐受性和蛋白表达周期方面存在明显差异，同一套参数并不适合直接用于293T、Expi293F和CHO-S等不同细胞体系。本文围绕三类常用表达细胞，整理贴壁与悬浮体系的PEI瞬时转染流程，重点分析转染前细胞密度、细胞活力、DNA用量、复合物制备、转染后换液或补料、温度调整和收获窗口等关键参数，并进一步梳理转染效率偏低、转染后细胞死亡、转染率正常但蛋白表达不足以及放大后产量下降等常见问题的排查思路，为重组蛋白和抗体从小规模验证到中等规模表达提供实验参考。

关键词：贴壁细胞转染、悬浮细胞转染、PEI转染试剂、细胞转染、293T细胞、Expi293F、CHO-S、瞬时转染、蛋白表达、抗体生产

一、为什么不同宿主细胞需要分别优化PEI瞬转参数

PEI瞬时转染的基本过程虽然都是先使带正电荷的PEI与带负电荷的质粒DNA形成复合物，再利用细胞内吞过程完成核酸递送，但真正决定最终蛋白产量的因素并不只有DNA和PEI本身。细胞的生长方式、转染当日密度、代谢状态、核酸摄取能力、转染后耐受性以及目标蛋白表达周期都会改变最终结果。因此，将293T细胞中已经验证的参数直接放大或复制到Expi293F和CHO-S体系中，往往难以获得相同的转染效率和蛋白产量。

HEK293T属于常见贴壁表达细胞，生长速度较快，对PEI转染的耐受度相对较高，通常适合重组蛋白、报告基因或抗体的小规模快速表达验证。由于细胞固定生长在培养表面，转染前汇合度、培养液体积以及复合物在孔内的分布均会影响结果。对于此类细胞，转染当天保持适宜汇合度通常比单纯提高PEI用量更重要。

Expi293F属于悬浮培养的293衍生细胞，可在较高细胞密度下生长，更适合摇瓶体系中的重组蛋白和抗体中等规模表达。与贴壁细胞相比，悬浮细胞不会受到培养面积限制，但对转染当日细胞密度、摇床转速、装液体积和补料时间更加敏感。复合物加入后需要迅速在整个培养液中均匀分散，否则局部PEI浓度过高可能影响细胞活率。

CHO-S同样采用悬浮培养，但其生物学特性和表达过程与293系列细胞并不完全相同。CHO细胞常用于抗体及其他复杂重组蛋白表达，翻译后加工能力是其重要特点之一，但其PEI瞬转通常需要更加细致地优化DNA用量、PEI比例、细胞密度和转染后培养条件。特别是在抗体表达中，转染后降温和分阶段补料可明显影响后续细胞存活时间及蛋白累计产量。

因此，建立标准化PEI转染工艺时，应先针对不同宿主细胞确定基础参数，再围绕具体表达载体和目标蛋白开展细化优化，而不是试图使用一套统一参数覆盖所有细胞体系。

二、HEK293T贴壁细胞的PEI瞬时转染流程

对于6孔板规模的HEK293T贴壁细胞转染，原始方案建议在转染前1天按照每孔2×10⁵个细胞的密度进行接种，并在37℃、5% CO₂环境下培养。接种密度的目的，是使细胞在第二天进入适合转染的生长阶段。如果细胞接种量过低，转染当天细胞数量不足，最终总表达量会受到限制；如果接种量过高，则容易使细胞提前达到高汇合度，细胞增殖速度下降，同样可能影响核酸摄取和表达。

转染当天应首先确认细胞汇合度达到约70%—80%。原始流程建议将培养体系更换为血清比例低于5%的低血清培养基，每孔保持2 mL培养总体积。在该条件下进行复合物加入，可减少高浓度血清成分对PEI-DNA复合物形成和细胞接触过程的影响。实际应用中，细胞对低血清条件的耐受程度可能不同，因此，正式建立流程时应同步观察换液后细胞形态和活力。

复合物制备时，每孔使用1 μg质粒DNA，以100 μL Opti-MEM进行稀释并混匀；另外将对应比例的PEI工作液使用100 μL Opti-MEM单独稀释。随后，将PEI稀释液缓慢加入DNA稀释液中，轻柔混匀并在室温孵育15分钟。这里需要保持DNA与PEI分别稀释后再混合，并尽可能固定加样顺序、混合方式和孵育时间，以减少复合物粒径和均一性变化带来的实验波动。

孵育完成后，将复合物逐滴加入细胞孔中，并轻轻晃动培养板，使复合物在孔内均匀分布，再将培养板放回培养箱继续培养。对于贴壁体系，不宜一次性将全部复合物集中加入某一位置，否则局部PEI浓度过高可能增加细胞损伤。

原始流程建议转染后18—24小时更换为完全培养基。如果细胞对当前低血清条件耐受良好，也可以根据实验结果评估是否省略换液。是否需要换液不能只根据固定时间决定，还可以结合转染后细胞形态、脱落比例和目标蛋白表达结果进行判断。

贴壁细胞HEK293 PEI转染实验流程

图1. 贴壁细胞HEK293 PEI转染实验流程

三、Expi293F悬浮细胞的PEI瞬转流程

Expi293F适用于摇瓶悬浮培养。原始方案以500 mL摇瓶规模为例，建议在转染前1天按照0.8×10⁶ cells/mL的密度接种，在37℃、120 rpm和5% CO₂条件下培养。与贴壁细胞依靠汇合度判断状态不同，悬浮体系需要更加关注实际细胞密度、细胞活率及其是否处于稳定对数生长期。

转染当天，细胞密度应达到1.8—2.2×10⁶ cells/mL，细胞活率不低于98%。高活率对于悬浮瞬转尤其重要，因为PEI加入后会在短时间内增加细胞负担，如果转染前已经存在较多死亡或受损细胞，培养体系中的碎片和释放成分也可能影响后续复合物与细胞的相互作用。

原始方案在该规模下使用150 μg质粒DNA。抗体表达时，重链和轻链质粒可从1:1比例作为基础条件进行测试。DNA使用5 mL Opti-MEM稀释，同时将对应量PEI MAX使用另外5 mL Opti-MEM进行稀释，再按照PEI稀释液加入DNA稀释液的顺序进行混合，并在室温孵育15分钟。

复合物完成组装后加入摇瓶，并通过轻柔混匀使其迅速分散在整个悬浮体系中。与贴壁细胞相比，悬浮体系中的复合物需要在更大的液体体积中均匀分布，因此加样速度、摇瓶运动状态和混匀方式都会影响局部浓度。

转染后24小时，原始方案建议补加相当于原培养体积10%—20%的新鲜表达培养基及对应补料。补料的主要目的是为进入高密度生长和蛋白表达阶段的细胞继续提供营养，同时延长细胞维持时间。对于抗体和其他分泌蛋白，最终产量往往取决于数天内的累计表达，因此，转染初期获得高阳性率并不意味着最终一定能获得较高蛋白产量。

四、CHO-S悬浮细胞的PEI瞬转流程

CHO-S的原始流程同样以500 mL摇瓶培养作为示例。转染前1天建议按照1.0×10⁶ cells/mL的密度接种，在37℃、120 rpm和5% CO₂条件下培养。转染当天，细胞密度达到2.5—3.0×10⁶ cells/mL，同时要求活率不低于95%。

相比Expi293F，CHO-S在该方案中的转染当天细胞密度更高，同时使用的总质粒DNA量也增加至200 μg。抗体表达时，原始方案采用重链与轻链2:3作为常用起始比例。不同抗体的链间表达平衡可能不同，因此，该比例更适合作为初始条件，而不是固定参数。后续可结合完整抗体产量和装配状态对重链、轻链比例继续进行梯度优化。

DNA使用5 mL Opti-MEM进行稀释，对应量的PEI MAX同样以5 mL Opti-MEM进行单独稀释，再按照相同方式形成复合物。为保证不同批次具有可比性，DNA浓度、PEI工作液浓度、稀释液体积、混合顺序及室温孵育时间都应保持一致。

CHO-S体系与Expi293F的一个重要差异，是转染后的温度和补料策略。原始方案建议在转染24小时后将培养温度降低至31℃，同时补加新鲜培养基和对应添加剂，并在转染48小时进行第二次补料。该策略通过降低细胞代谢速率，使培养周期得到延长，为抗体等分泌蛋白提供更长的累计表达时间。

降温虽然可能减慢细胞增殖，但蛋白生产阶段并不一定要求细胞继续保持最高生长速度。只要细胞能够维持较高活率并持续完成目标蛋白表达和分泌，适当延长培养时间反而可能提高最终累计产量。因此，在CHO瞬时表达中，需要区分“细胞扩增最快的温度”和“目标蛋白累计产量更高的温度”。

悬浮细胞PEI转染流程

图2. 悬浮细胞PEI转染流程

五、转染后的温度控制为什么会影响蛋白产量

PEI-DNA复合物进入细胞后，目标蛋白还需要经历质粒释放、入核、转录、翻译、折叠、修饰和分泌等多个阶段。因此，转染完成并不是整个表达工艺的终点。细胞在接下来数天中的活率和代谢状态，往往直接决定最终能够累计多少目标蛋白。

293T和Expi293F的基础培养条件均以37℃为主。对于快速表达和短周期检测，维持正常生长温度可以获得较快的蛋白表达速度。但对于CHO-S抗体表达，原始方案建议在转染后24小时将温度由37℃降低至31℃。降温后，细胞增殖速度和代谢速率下降，培养物进入平台期的时间可能延后，使活细胞能够维持更长时间。

这种策略尤其适合分泌型抗体，因为抗体总产量取决于单位细胞生产能力与有效培养时间的共同作用。即使降温后瞬时细胞生长速度降低，只要细胞存活时间延长并维持持续分泌，最终收获时的累计蛋白量仍可能提高。

温度调整的实际效果会受到CHO细胞株、培养基、表达载体和目标抗体特性影响，因此31℃应理解为原始方案中的工作参数。建立新体系时可以围绕该条件设置相邻温度进行比较，并同步监测细胞活率、抗体浓度和产品质量。

六、悬浮细胞为什么更适合采用分阶段补料

在悬浮培养过程中，细胞密度会持续增加，葡萄糖、氨基酸和其他营养物质不断被消耗，同时乳酸和其他代谢物逐渐积累。如果转染后始终使用初始培养基，细胞可能在目标蛋白尚未达到最大累计量之前就进入营养限制状态。

Expi293F原始方案在转染后24小时补充10%—20%体积的新鲜表达培养基和补料。CHO-S则在24小时降温的同时进行第一次补充，并在48小时继续补料。两种策略都体现了同一个逻辑，即在细胞进入高表达阶段时继续提供营养，而不是仅依赖转染前培养液维持整个表达周期。

分批补料还能够避免一次加入过多营养成分导致培养环境突然变化。对于需要持续数天表达的悬浮体系，可以在实验开发阶段同步记录活细胞密度、活率和目标蛋白浓度，判断不同补料时间对表达曲线的影响。

贴壁293T则通常通过换液更新培养环境。由于6孔板等体系培养体积较小，完全更换培养液操作简单，因此原始方案建议在18—24小时更换为完全培养基。对于耐受良好的细胞，也可以通过对照实验评估是否必须执行该步骤。

七、293T、Expi293F和CHO-S的最佳收获窗口不同

不同宿主细胞的表达速度不同，胞内蛋白与分泌型蛋白的积累过程也不同。因此，确定转染成功后还需要进一步建立时间梯度，而不能统一在某一个固定时间点收获。

293T的表达速度相对较快。原始资料显示，胞内蛋白通常在转染后48—72小时达到较高水平，而分泌型蛋白和抗体通常在72—96小时进入较高表达阶段。对于仅用于功能验证的小规模实验，较早收获可以缩短实验周期，但若目标是获得更多分泌蛋白，则应适当延长培养时间。

Expi293F中，胞内蛋白通常在72—96小时达到较高水平，分泌型蛋白和抗体则多在96—120小时达到较高累计量。这一时间差与悬浮细胞在较高密度条件下继续生长和表达有关。

CHO-S的整体表达周期更长，原始方案中抗体通常在120—168小时达到较高水平。该结果也与前述转染24小时后降温及分阶段补料策略相一致，其目的就是让细胞保持较长有效表达周期。

收获时间过早时，目标蛋白尚未充分积累；收获过晚时，随着细胞活率下降，培养上清中的细胞内容物和蛋白酶可能增加，目标蛋白也可能发生降解。因此，更稳妥的方法是在新体系建立阶段设置多个时间点，绘制目标蛋白浓度、细胞活率和细胞密度的变化曲线，再选择合适的收获窗口。

八、转染效率偏低时应先排查细胞和质粒

PEI转染效率下降往往不是由单一问题造成。常见原因包括细胞状态不佳、质粒纯度不足、DNA与PEI比例不合适、复合物制备不稳定或使用了不适合的稀释体系。实际排查时，应优先检查前端基础条件，而不是立即增加PEI用量。

如果同一方案此前能够稳定转染，而近期结果突然下降，应首先比较细胞代次、转染前活率、细胞密度和培养历史。长期高密度培养、刚复苏不久或已经出现生长速度下降的细胞，即使使用完全相同的DNA和PEI，也可能出现明显不同的结果。

质粒质量同样需要重点排查。低纯度或内毒素较高的质粒既可能影响PEI-DNA复合物形成，也可能增加转染后细胞应激。因此，出现效率下降时，可重新制备低内毒素质粒，并确认质粒浓度和完整性。

如果细胞和DNA状态正常，再进一步调整DNA与PEI比例，并严格固定PEI加入DNA的混合顺序、Opti-MEM稀释体积和15分钟孵育时间。只有基础操作保持一致，配比梯度之间的结果才具有解释价值。

九、转染后细胞大量死亡时如何定位原因

转染后出现明显细胞死亡，常见原因包括DNA或PEI总量过高、游离PEI过多、复合物孵育时间过长，以及细胞长时间暴露于不适合的转染培养环境。

PEI具有较强正电荷，如果用量过高，会增加与细胞膜和细胞内组分的非特异性相互作用。因此，提高PEI并不是提升转染率的无限策略。出现细胞死亡时，可先在维持DNA量不变的情况下减少PEI，再判断细胞活率和转染效率能否获得更好的平衡。

复合物孵育时间也需要标准化。原始流程采用室温15分钟。如果孵育时间过长，颗粒可能继续聚集，使较大复合物比例上升，并增加细胞负担。多组实验应按照时间顺序分批制备，避免第一组已经孵育很长时间，而最后一组刚完成复合就同时加样。

对于贴壁细胞，如果转染后细胞状态持续下降，可以根据原始排查方案在转染后4—6小时更换新鲜培养基，以缩短细胞持续接触高浓度PEI的时间。但是否提前换液还要结合转染效率进行验证，因为过早移除复合物也可能降低核酸摄取。

十、转染效率正常但蛋白表达量低的原因

转染阳性率达到预期，并不代表目标蛋白一定能够高水平表达。报告基因或转染率主要说明质粒已经进入一定比例的细胞，而最终蛋白量还会受到启动子、信号肽、密码子、蛋白折叠、分泌效率和培养时间等多项因素影响。

如果转染效率稳定但目标蛋白浓度持续偏低，应先判断表达载体本身是否适合当前宿主细胞。启动子活性、信号肽选择以及重链和轻链表达比例均可能构成限制因素。抗体表达时，即使两条链都成功进入细胞，如果比例严重失衡，也可能影响完整抗体装配和分泌。

收获时间过早是另一个常见原因。特别是在CHO-S和Expi293F体系中，分泌型蛋白需要较长时间累计，因此，仅在48小时检测可能低估真实表达潜力。应根据不同细胞系的表达窗口设置时间梯度。

培养温度和补料同样会影响最终产量。CHO-S可以通过转染后24小时降至31℃延长表达周期，悬浮293体系可以通过24小时补料维持营养。对于易降解蛋白，还需要结合目标蛋白稳定性判断是否需要缩短收获周期或采取其他保护措施。

十一、小试稳定但放大后产量下降的常见原因

从6孔板、小摇瓶放大至更大摇瓶时，最容易被忽略的问题是局部混合条件发生了变化。虽然DNA和PEI可以按培养体积等比例增加，但复合物制备体积、加样方式、摇瓶装液量和混合时间如果没有同步调整，细胞实际接触到的复合物状态可能与小试完全不同。

较大体积的PEI和DNA稀释液需要保证充分混合。如果简单将小试操作按倍数放大，局部浓度可能升高并产生颗粒不均一。原始方案建议放大时采用温和方式混匀复合物，同时优化摇瓶转速和装液量，以保证复合物加入后能够尽快在培养体系中分散。

悬浮细胞放大还需要保持转染当日细胞密度与小试一致。如果为了追求更高起始细胞量而直接提高密度，营养消耗、氧需求和细胞间相互作用都会发生改变，使原有DNA和PEI比例失去可比性。

因此，放大实验更适合按照细胞密度、单位细胞DNA量、复合物局部浓度和培养环境逐级进行，而不是只根据最终培养体积计算总试剂量。

十二、三类细胞的参数不能简单互换

293T、Expi293F和CHO-S虽然都可以使用PEI开展瞬时表达，但三者的基础参数存在明显差异。293T依赖转染时70%—80%的贴壁汇合度；Expi293F转染时细胞密度约为1.8—2.2×10⁶ cells/mL，并要求活率不低于98%；CHO-S则在2.5—3.0×10⁶ cells/mL和不低于95%活率的条件下进行转染。

DNA用量也随体系发生变化。6孔板293T示例条件为每孔1 μg DNA，500 mL摇瓶Expi293F示例条件为150 μg，CHO-S为200 μg。抗体共转染时，Expi293F使用重链与轻链1:1作为常用起始比例，而CHO-S示例条件为2:3。

转染后的培养策略更加不同。293T主要通过18—24小时换液维持状态，Expi293F在24小时进行补料，而CHO-S在24小时降至31℃并补料，48小时再次补料。收获时间也从293T的48—96小时逐渐延长到CHO-S抗体表达的120—168小时。

这些差异说明，宿主细胞本身就是PEI转染工艺中的重要变量。优化时需要围绕每一种细胞单独建立基础流程，再进一步根据目标蛋白调整，而不能只以PEI规格作为唯一工艺依据。

十三、如何建立可重复的PEI瞬转标准流程

要提高PEI瞬转重复性，首先需要将容易被忽略的操作细节转变为明确参数。例如，细胞转染前培养时间、接种密度、转染当日活率、DNA浓度、PEI工作液浓度、Opti-MEM体积、PEI加入DNA的速度、孵育时间以及复合物加入培养体系后的混匀方式，都应被记录。

对于贴壁细胞，应固定培养板规格、每孔接种数量、转染当日汇合度和培养液体积；对于悬浮细胞，则应记录摇瓶规格、实际装液量、摇床转速、细胞密度和活率。只要其中某一项发生较大改变，就可能需要重新确认转染条件。

蛋白表达实验还需要同步记录转染后24小时、48小时以及收获时的细胞活率和目标蛋白浓度。若只记录最终产量，很难判断问题是发生在核酸递送阶段，还是发生在后续细胞培养和蛋白表达阶段。

通过将转染效率、细胞活率、目标蛋白浓度和培养时间结合，可以逐步确定适合具体细胞和蛋白的工作区间，从而形成可重复的标准操作流程。

十四、常见问题

Q1：293T转染当天为什么建议保持70%—80%汇合度？

该阶段细胞通常仍保持较活跃的生长状态，同时孔内已经具有足够数量的细胞用于表达。汇合度过低会限制最终总细胞量，过高则可能使细胞生长速度下降，从而影响核酸摄取和后续表达。

Q2：Expi293F转染前为什么要求较高活率？

悬浮体系中PEI加入后会增加细胞负担。如果转染前已经存在较多死亡细胞，培养环境容易进一步恶化。原始方案要求转染当天活率不低于98%，用于保证后续扩增和表达阶段具有足够健康细胞。

Q3：CHO-S为什么在转染24小时后降至31℃？

降温可降低细胞代谢和增殖速度，并延长细胞维持时间。对于抗体等分泌型蛋白，更长的有效表达周期可能提高最终累计产量。31℃属于原始流程中的具体工作参数，其他体系应重新确认。

Q4：转染率很高但抗体产量不高，应该先检查什么？

除转染率外，应进一步检查重链和轻链比例、表达载体、信号肽、细胞活率、补料、收获时间和蛋白稳定性。高转染率只表示较多细胞获得了表达模板，并不能保证目标蛋白能够高效装配和分泌。

Q5：从小摇瓶放大后是否可以直接按体积增加DNA和PEI？

不建议只按总体积进行简单换算。放大后还需要保持转染细胞密度、DNA与PEI比例、复合物形成浓度、加样方式、摇瓶装液量和混合状态尽量具有可比性，并通过逐级放大验证。

十五、总结

293T、Expi293F和CHO-S均可用于PEI瞬时转染，但三种细胞在培养方式、适宜细胞密度、DNA用量、转染后管理和目标蛋白收获时间方面存在明显差异。HEK293T适合贴壁小规模快速验证，Expi293F适合悬浮条件下的重组蛋白与抗体中等规模表达，CHO-S则可用于需要较长表达周期和复杂蛋白加工的抗体表达研究。

293T的6孔板示例流程以每孔2×10⁵个细胞进行前一天接种，转染时保持70%—80%汇合度，每孔使用1 μg DNA并在室温完成15分钟复合物孵育。Expi293F在转染当天控制于1.8—2.2×10⁶ cells/mL和不低于98%活率，500 mL摇瓶示例使用150 μg DNA，并在转染后24小时补充10%—20%新鲜培养基及对应补料。CHO-S在2.5—3.0×10⁶ cells/mL和不低于95%活率条件下转染，示例使用200 μg DNA，并在24小时后将培养温度降至31℃，分别在24小时和48小时进行补料。

转染成功之后，温度、补料和收获时间仍会持续影响最终蛋白产量。293T分泌蛋白通常在72—96小时进入较高表达阶段，Expi293F约为96—120小时，CHO-S抗体表达则可延长至120—168小时。因此，PEI瞬转优化不能只围绕转染率本身，而应将转染效率、细胞活率、目标蛋白浓度和培养周期共同作为工艺评价指标。

当出现效率偏低、细胞死亡、表达不足或放大后产量下降时，应按照细胞状态、质粒质量、DNA与PEI配比、复合物制备、培养条件和放大参数逐层排查。通过固定关键变量并逐级验证，可以建立更加稳定、可重复的PEI瞬时表达流程，为重组蛋白和抗体的小试及中等规模制备提供实验基础。

本文基于Polysciences公开技术资料及相关PEI瞬时转染实验信息整理，用于293T、Expi293F、CHO-S细胞转染及重组蛋白、抗体瞬时表达等方向的技术交流与实验参考。25 kDa线性PEI、40 kDa PEI MAX等不同规格PEI在具体细胞体系中的适宜用量和配比可能存在差异，正式实验前仍需结合细胞状态、培养基和目标蛋白进行梯度验证。