CAR-NK细胞垂直轮反应器扩增与灌流放大|PBS mini生物反应器应用方案

摘要：CAR-NK细胞制造需要兼顾扩增倍数、终细胞产量、培养过程稳定性、细胞健康状态和终末效力。传统静态培养在扩大生产规模后，可能面临操作步骤增加、批次一致性控制困难和培养参数难以直接迁移等问题。本文基于PBS Biotech与GeneFab联合发布的研究资料，梳理CAR-NK细胞在PBS垂直轮生物反应器中的工艺开发过程。研究先使用0.1 L缩小模型优化搅拌转速与接种密度，再将参数放大至3 L体系，对比批培养、补料批培养和ATF灌流三种策略。结果显示，30—50 rpm能够支持较稳定的细胞扩增，较低接种密度可获得更高扩增倍数；补料批培养能够延缓细胞进入生长平台期，而ATF灌流可使扩增倍数较同供体补料批培养提高2.6倍。反应器扩增后的CAR-NK细胞还表现出较好的功能活性，为高密度扩增和逐级放大提供了工艺参考。

关键词：垂直轮生物反应器、PBS Mini、CAR-NK、PBS 3L、ATF灌流工艺、补料批培养、PBS垂直轮生物反应器、CAR-NK高密度扩增、工艺放大、批培养、NK细胞扩增

一、CAR-NK规模化扩增为什么需要反应器工艺

NK细胞具有识别并清除异常细胞的能力，经过嵌合抗原受体改造后，可进一步增强对特定肿瘤相关靶点的识别能力。随着CAR-NK相关研究逐步进入工艺开发和临床制造阶段，如何在保持细胞身份、CAR表达和功能活性的同时获得足够数量的细胞，成为生产体系设计中的重要问题。

传统静态培养体系在早期研究和小规模制备中操作较为直接，但随着目标细胞数量增加，需要使用更多培养容器并开展多次人工操作。容器数量增加后，接种密度、换液时间、气体交换和培养空间差异都可能增加批次波动，也会提高过程管理的复杂程度。若从小规模静态体系直接切换到大体积培养设备，还需要重新确定混合、供氧、剪切和代谢控制条件。

搅拌式生物反应器可以在相对封闭的系统中控制工作体积、混合状态和培养环境，更适合开展过程监测和逐级放大。但免疫细胞通常以悬浮状态生长，对局部剪切力、细胞沉降和过度碰撞较为敏感，因此，反应器内部流体环境是否温和且均匀，会直接影响细胞扩增和健康状态。

PBS垂直轮生物反应器采用垂直轮式混合结构，研究资料将其用于CAR-NK细胞从0.1 L到3 L的扩增工艺开发。整个研究覆盖小规模参数筛选、培养模式比较、ATF灌流强化、细胞质量评价和功能验证，形成了较完整的工艺开发路径。

研究采用人外周血来源的CAR-NK细胞。细胞先由经辐照处理的K562滋养层进行激活，再通过逆转录型载体完成CAR导入，随后分别在PBS-0.1 Mini和PBS-3垂直轮生物反应器中培养。研究重点包括搅拌转速、接种密度、培养基补充方式、灌流启动策略、细胞扩增倍数、代谢变化、凋亡状态、CAR表达和细胞效力。

PBS Mini垂直轮反应器系列

图1. PBS Mini垂直轮反应器系列，包括PBS Mini基座和0.1 L、0.5 L两种规格的一次性培养容器

二、从细胞活化到冻存的整体工艺设计

研究首先在PBS-0.1 Mini中开展参数筛选，以较低培养体积比较不同搅拌速度和接种密度。完成小试条件确认后，再将工艺转移至3 L反应器，对批培养和补料批培养进行比较，并进一步连接Repligen ATF2系统建立灌流工艺。

这种开发顺序的核心，是先在较小工作体积下识别影响细胞扩增的主要变量，再将已确认的条件用于中试规模。相比直接在3 L系统中进行多参数筛选，0.1 L缩小模型可以减少细胞、培养基和设备使用量，并支持更多平行条件。

研究中的扩增流程覆盖细胞活化、CAR导入、反应器接种、培养扩增、补料或灌流、细胞收获和冻存。除细胞数量外，研究还检测细胞健康状态和终末效力，以确认产量提高是否伴随明显质量下降。

CAR-NK补料批培养与灌流培养流程

图2. 补料批培养与灌流培养体系下，NK细胞从活化、扩增至冻存的工艺流程

三、0.1 L小试中的搅拌转速筛选

悬浮细胞反应器中的搅拌速度需要同时满足两个要求：一方面，搅拌应足以维持细胞均匀悬浮并促进营养和代谢物分布；另一方面，速度不能过高，以免增加流体剪切和细胞碰撞。

研究比较了10、30、50和100 rpm四档搅拌速度。在10 rpm条件下，培养体系混合不足，出现较明显的细胞沉降和团聚，细胞扩增受到限制。在100 rpm条件下，较高的剪切环境使细胞凋亡比例增加，不利于维持细胞健康。

30和50 rpm均能够支持较稳定的细胞扩增。在供体DA、100×10³ cells/mL接种密度和批培养条件下，30 rpm组在12天培养中获得36倍扩增，50 rpm组获得30倍扩增，而10 rpm组为17倍。该结果说明，适度提高搅拌速度能够改善混合和细胞悬浮，但继续提高到100 rpm并未带来更高产量。

在另一组供体DB实验中，50 rpm恒速培养的扩增倍数为31倍，100 rpm恒速组为24倍，先使用50 rpm再切换到100 rpm的变速组为25倍。50 rpm组的终活细胞数量也高于两个涉及100 rpm的条件，进一步说明该研究体系中更高搅拌速度没有改善扩增结果。

表1.PBS-0.1中参数评估与扩增结果

四、搅拌速度与葡萄糖、乳酸变化的关系

细胞扩增过程中，葡萄糖消耗和乳酸积累可以反映培养体系的营养利用及代谢状态。研究数据显示，在30和50 rpm条件下，细胞扩增倍数约为10 rpm组的2倍。经过12天培养后，葡萄糖浓度下降至约1.5 g/L，乳酸浓度升高至约1.4 g/L。

这些数据与细胞生长曲线相互对应。随着细胞数量增加，葡萄糖消耗速度提高，乳酸逐渐积累。当营养浓度下降并且代谢产物达到一定水平后，细胞扩增速度开始放缓。

100 rpm恒速组与50 rpm切换至100 rpm组在终细胞密度方面较为接近，但均未超过50 rpm恒速培养。培养第10天时，葡萄糖浓度约为2 g/L，乳酸浓度约为0.8 g/L，细胞生长也逐渐进入平台期。

研究结果表明，转速优化不能只观察混合是否充分，还需要结合活细胞密度、凋亡状态和代谢变化进行判断。对于该CAR-NK培养体系，30—50 rpm在混合效率和细胞耐受之间形成了相对合适的区间。

不同搅拌速度下的扩增与代谢结果

图3A-B. 30 rpm与50 rpm搅拌转速下的细胞扩增倍数约为10 rpm组的2倍。培养12天后，葡萄糖浓度降至约1.5 g/L，乳酸浓度升至约1.4 g/L

高转速与变速培养结果

图3C-D. 100 rpm恒速与50→100 rpm变速条件下的终细胞密度相近，而50 rpm恒速条件下的扩增效果较优。第10天葡萄糖浓度约为2 g/L，乳酸浓度约为0.8 g/L

五、接种密度如何影响扩增倍数与终细胞量

研究在补料批培养条件下比较了50×10³、100×10³、250×10³和400×10³ cells/mL四档接种密度。结果显示，最低接种密度50×10³ cells/mL获得最高扩增倍数，第10天达到50倍。

随着接种密度升高，扩增倍数逐步下降。100×10³ cells/mL组扩增19倍，250×10³ cells/mL组扩增18倍，400×10³ cells/mL组扩增13倍。较高起始细胞密度会加快营养消耗和代谢物积累，使培养体系更早进入生长平台期。

扩增倍数和终细胞总量需要结合判断。50×10³ cells/mL组虽然扩增倍数最高，但250×10³ cells/mL组的终活细胞量达到4.5×10⁸，高于其他接种密度。这说明，最低接种密度有利于获得更大的相对扩增幅度，但并不一定在固定培养周期内获得最高绝对细胞数量。

综合扩增倍数、终细胞量和后续放大需求，研究选择100×10³ cells/mL作为3 L中试工艺的基准接种密度。这一选择在较低种子用量、培养时间和终细胞产出之间进行了平衡。

培养基中还添加了1 g/L Pluronic F-68作为剪切保护剂，用于降低搅拌过程中流体作用对细胞造成的损伤，提高培养体系的稳定性。

不同接种密度下的细胞扩增与代谢变化

图3E-F. 50×10³ cells/mL的较低接种密度获得较高扩增倍数。培养第10天，50×10³ cells/mL与100×10³ cells/mL组的代谢特征相近

六、从0.1 L向3 L转移时重点观察什么

完成0.1 L参数筛选后，研究将工艺转移至PBS-3反应器。放大验证的重点并不只是3 L体系能否产生更多细胞，而是观察小试与中试之间的细胞生长动力学、代谢趋势和质量属性是否保持相近。

如果小规模和大规模反应器中的流体环境具有可比性，那么小试阶段确定的搅拌、接种和补料逻辑就可以用于中试工艺。若放大后细胞生长速度、葡萄糖消耗或乳酸积累出现明显变化，则需要重新调整参数。

研究数据显示，PBS-0.1和PBS-3中的CAR-NK细胞表现出相近的生长趋势及代谢变化，说明0.1 L缩小模型可以用于3 L工艺开发。该结果为后续扩大工作体积提供了实验基础。

七、批培养与补料批培养的工艺差异

3 L研究比较了批培养和补料批培养两种策略。批培养从3 L全体积开始，培养过程中不再补充新鲜培养基。补料批培养则从2 L工作体积开始，在接种后第3天加入1 L新鲜培养基，使总体积达到3 L。

批培养操作较为简单，但随着细胞数量增加，培养基中的营养物质逐步消耗，乳酸等代谢物持续积累。补料批培养在第3天补充新鲜培养基，既增加了可利用营养，也稀释了已经积累的代谢产物，从而延缓细胞进入平台期。

实验结果显示，补料批培养的总细胞产量高于批培养。0.1 L与3 L体系的细胞生长动力学和代谢趋势保持较好一致性，也说明小试参数能够较顺利地迁移至中试规模。

批培养与补料批培养扩增及代谢结果

图4. 批培养与补料批培养结果。（A）非灌流培养中的细胞密度变化；（B）葡萄糖和乳酸浓度变化，实线代表葡萄糖，虚线代表乳酸；（C）培养批次的细胞计数及扩增倍数统计

八、代谢指标可用于判断培养体系何时进入平台期

研究观察到，当葡萄糖浓度下降至约2.0 g/L、乳酸浓度超过1.0 g/L时，细胞生长逐渐进入平台期。该现象说明，细胞扩增减慢与营养消耗和代谢产物积累具有对应关系。

固定日期补料或启动灌流虽然便于建立标准操作流程，但不同供体、初始细胞状态和生长速度可能使实际营养需求发生变化。如果只按照培养天数执行操作，可能出现细胞尚未达到较高密度就提前更换培养基，或已经出现明显代谢压力却尚未启动灌流的情况。

因此，研究提出可根据细胞密度和代谢水平判断灌流启动时间。葡萄糖、乳酸和活细胞密度能够为培养过程提供更直接的反馈，使培养基补充更接近细胞实际需求，并改善培养基利用效率。

九、ATF灌流如何强化3 L扩增工艺

为了进一步提高细胞密度和总产量，研究将PBS-3反应器与Repligen ATF2系统连接，建立细胞截留和培养基连续交换流程。灌流速度设置为1.5 L/天，即0.5 VVD，表示每天更换相当于反应器工作体积50%的培养基。

ATF系统通过交替切向流使培养液经过细胞截留组件，细胞被保留在反应器中，而部分代谢物和使用后的培养液被移出，同时补充等量新鲜培养基。这一过程可以在不大量损失细胞的情况下持续补充营养并降低代谢物浓度。

灌流工艺并非从接种开始立即运行，而是根据培养进程在适当时间启动。研究对两个灌流批次进行了比较，其中4号批次的接种密度为250 cells/μL，5号批次为300 cells/μL。通过监测细胞密度和葡萄糖、乳酸水平，研究确定了不同阶段的灌流节点。

ATF灌流培养工艺

图5. ATF灌流培养工艺。（A）两个灌流批次的细胞密度变化及灌流启动节点；（B）葡萄糖和乳酸变化；（C）细胞收获总量与扩增倍数；（D）灌流运行计划

十、灌流工艺使扩增倍数提高2.6倍

研究结果显示，与同一供体的补料批培养相比，灌流模式下CAR-NK细胞扩增倍数提高2.6倍。培养体系获得的较高活细胞密度达到5×10⁶ cells/mL，在3 L工作体积中，单批总活细胞数量达到1.5×10⁹。

灌流提高细胞产量的主要基础，是持续补充新鲜营养并移除部分乳酸等代谢产物。与一次性补料相比，连续培养基交换可以在高细胞密度阶段维持更稳定的培养环境，延长有效扩增时间。

总活细胞数量和扩增倍数代表不同工艺信息。扩增倍数反映细胞相对于初始接种量的增长幅度，终细胞数量则决定单批可获得的实际产量。灌流工艺同时改善了这两个指标，说明该策略不仅依靠提高起始接种量获得更多细胞，而是延长了高效扩增阶段。

十一、灌流启动没有明显降低细胞健康状态

高密度培养和外接循环系统可能增加细胞承受的流体作用，因此，研究对灌流启动前后的细胞健康状态进行了评价。结果显示，灌流前后细胞整体健康水平基本一致，健康细胞占比稳定在60%以上。

该结果表明，在本研究设定的垂直轮混合与ATF运行条件下，灌流启动没有对NK细胞造成明显额外损伤。PBS垂直轮反应器提供相对温和的流体环境，ATF系统则以较低剪切方式进行细胞截留和培养基交换。

这一结果仍需要结合具体运行参数理解。ATF流量、膜组件、反应器搅拌速度、细胞密度和培养时间均可能影响细胞状态。将研究参数转移至其他细胞来源或更大规模时，仍需重新确认细胞健康指标。

灌流启动前后细胞健康状态

图6. 5号灌流培养批次的细胞健康状态。灌流启动前后，细胞整体健康水平基本一致

十二、灌流使葡萄糖和乳酸维持在较稳定区间

批培养和补料批培养中，葡萄糖会随细胞扩增逐渐下降，乳酸则不断积累。当细胞密度较高时，这种变化会加快，最终限制继续扩增。

灌流通过连续加入新鲜培养基并移除部分使用后的培养液，使葡萄糖和乳酸浓度保持在相对稳定范围。营养与代谢环境得到控制后，细胞能够在更高密度下继续扩增。

研究同时指出，根据实时细胞密度和代谢状态启动灌流，比完全按照固定培养天数启动更有利于培养基利用。若启动过早，会在细胞需求尚低时消耗较多培养基；若启动过晚，则可能已经出现营养不足和代谢压力。

十三、细胞数量增加后仍需验证CAR表达和功能

细胞治疗生产不能只关注扩增数量。高密度培养、搅拌和培养基交换都可能影响细胞表型、CAR表达和功能状态，因此需要将细胞质量检测纳入工艺比较。

研究对反应器扩增后的CAR-NK细胞进行了CAR表达、凋亡和功能评价，并与静态G-Rex培养体系进行比较。结果显示，反应器扩增细胞的CAR表达保持正常，冻存复苏后的细胞活性也符合研究要求。

这些结果说明，在本研究条件下，扩增倍数和细胞总量的提升没有以明显牺牲CAR表达或复苏活性为代价，为后续工艺应用提供了质量方面的支持。

十四、反应器扩增细胞的相对效力比较

研究使用LDH方法评价CAR-NK细胞对目标细胞的作用能力，并将PBS反应器培养组与静态G-Rex培养组进行比较。

培养第7天时，PBS反应器组的相对效力为G-Rex组的1.77倍；培养第8天时，该比值提高至2.56倍。结果表明，PBS反应器扩增的CAR-NK细胞不仅获得了较高数量，也保持了较强的功能活性。

动态培养环境可能通过改善营养分布、代谢状态和细胞间接触条件，影响细胞功能。但该研究结果主要用于比较特定培养条件下的相对效力，不能在缺少进一步机制实验时将功能变化归因于某一个单独因素。

PBS反应器与G-Rex培养细胞的效力比较

图7. 静态G-Rex培养体系与5号灌流培养批次的细胞相对效力比较。（A）接种后第7天结果；（B）接种后第8天结果

十五、0.1 L与3 L体系表现出相近的生长趋势

同一供体来源的CAR-NK细胞在PBS-0.1和PBS-3反应器中进行补料批培养后，表现出相近的细胞生长动力学。该结果说明，缩小模型可以较好模拟3 L反应器中的培养趋势。

研究还在PBS-3体系内比较了补料批培养与灌流培养。灌流策略获得更高的终细胞产量，进一步验证持续培养基交换对高密度扩增的促进作用。

从工艺开发角度看，缩小模型的价值不仅在于减少实验成本，还在于支持更高效的参数筛选。只有当缩小模型和中试设备之间具有可比性时，小规模实验获得的结果才能真正降低放大风险。

不同反应器规模和培养模式的细胞密度变化

图8. 单一供体来源CAR-NK细胞在垂直轮生物反应器中的密度变化。（A）PBS-3与PBS-0.1补料批培养的生长趋势；（B）PBS-3中补料批培养与灌流培养的比较

十六、工艺放大不能只按照体积比例换算

研究显示，PBS-0.1与PBS-3具有较好的工艺可比性，但这并不意味着任何规模之间都可以只按照工作体积等比例增加细胞和培养基。反应器放大还需要关注混合时间、功率输入、流体速度、气体交换、传感器位置和细胞截留效率。

从3 L继续扩大时，应重点确认细胞悬浮是否均匀、局部剪切是否增加、葡萄糖和乳酸是否能够代表整个罐体状态，以及ATF循环是否会改变细胞健康和回收率。

培养基补充与灌流量也需要根据实际细胞需求调整。固定使用0.5 VVD可以作为研究起点，但当细胞密度、代谢速度或工作体积改变后，合适的交换速率可能发生变化。

十七、80 L理论产量的推算应如何理解

研究依据3 L灌流培养获得的细胞密度，对80 L规模进行了理论估算。在相近细胞密度和工艺表现能够维持的前提下，80 L灌流培养的理论总细胞产量可达到4×10¹¹。

参考文献中NK细胞相关疗法的给药剂量通常约为每公斤体重5×10⁶至1×10⁸个细胞，因此，该理论产量有可能支持多个治疗批次。

不过，这一结果属于基于现有数据的规模推算，并不是80 L实测结果。实际扩大到80 L后，还需要验证细胞生长、灌流效率、收获回收率、冻存损失和质量属性是否保持一致。

十八、该工艺仍存在继续优化的空间

白皮书指出，当前工艺尚未达到培养体系的理论上限。后续可以继续优化接种密度、搅拌策略、补料组成、灌流启动条件和VVD设置，以提高细胞密度及培养基利用效率。

基于实时代谢数据的反馈式灌流，是后续值得关注的方向。该策略可以根据葡萄糖消耗、乳酸积累和细胞密度变化动态调整培养基交换，而不是在整个培养周期中始终使用固定速率。

不同供体来源的NK细胞还可能存在扩增能力和代谢速度差异，因此，工艺稳健性评价需要纳入更多供体和独立生产批次。只有在不同起始细胞条件下均能获得稳定结果，工艺参数才具有更广泛的适用性。

十九、常见问题

Q1：为什么10 rpm条件下的细胞扩增效果较低？

研究观察到，10 rpm条件下混合效率不足，并出现细胞沉降和团聚。细胞在培养容器中分布不均，会影响营养获得和培养环境一致性，因此扩增倍数低于30和50 rpm组。

Q2：搅拌速度是否越高越有利于细胞悬浮？

不是。较高速度虽然能够改善混合，但也会增加细胞承受的流体作用。研究中100 rpm组的凋亡比例增加，终细胞量和扩增倍数也未超过50 rpm组。

Q3：为什么低接种密度的扩增倍数更高？

低接种密度下，单位细胞可利用的营养和培养空间相对更多，培养体系进入平台期的时间较晚，因此相对于初始细胞数量可以获得更高扩增倍数。但最高扩增倍数并不一定对应最高终细胞总量。

Q4：补料批培养与灌流培养有什么区别？

补料批培养是在特定时间一次性加入新鲜培养基，以补充营养并稀释代谢物；灌流培养则持续移出部分培养液并补充新鲜培养基，同时利用细胞截留系统将细胞保留在反应器中。

Q5：为什么灌流工艺需要监测葡萄糖和乳酸？

葡萄糖消耗和乳酸积累能够反映细胞代谢及培养环境变化。研究显示，当葡萄糖下降至约2.0 g/L、乳酸超过1.0 g/L时，细胞逐渐进入平台期，因此这些指标可以为灌流启动和速率调整提供参考。

Q6：0.1 L参数能否直接用于所有更大规模反应器？

本研究验证了PBS-0.1和PBS-3之间具有较好的生长与代谢一致性，但继续扩大规模时仍需确认混合、流体环境、代谢控制和细胞截留情况，不能只按体积进行简单换算。

二十、总结

本研究从PBS-0.1 Mini小试开始，对CAR-NK细胞扩增中的搅拌转速和接种密度进行了系统筛选。结果显示，30—50 rpm可以在维持细胞悬浮和减少额外损伤之间取得较好平衡；50×10³ cells/mL获得最高扩增倍数，而100×10³ cells/mL被选为3 L放大的基准接种密度。

在3 L体系中，补料批培养通过第3天补充新鲜培养基，延缓了营养耗尽和代谢物积累，细胞产量优于批培养。PBS-0.1与PBS-3表现出相近的生长动力学和代谢趋势，为缩小模型用于中试开发提供了支持。

连接ATF2系统后，0.5 VVD灌流工艺使细胞扩增倍数较同供体补料批培养提高2.6倍，较高活细胞密度达到5×10⁶ cells/mL，3 L单批总活细胞量达到1.5×10⁹。灌流启动前后细胞健康状态没有出现明显变化，说明研究所采用的反应器和截留条件能够支持高密度培养。

功能检测显示，PBS反应器扩增的CAR-NK细胞在第7天和第8天的相对效力分别达到G-Rex组的1.77倍和2.56倍。结合正常CAR表达和冻存复苏结果，该工艺在产量、放大一致性和细胞功能方面均获得了较完整的验证。

CAR-NK扩增白皮书

图9. PBS Biotech、GeneFab与Repligen联合发布的CAR-NK细胞扩增研究资料

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本文基于PBS Biotech与GeneFab联合发布的专项白皮书资料整理，用于CAR-NK扩增、垂直轮生物反应器、补料批培养、ATF灌流和工艺放大等方向的技术交流与实验参考。不同细胞供体、CAR构建、培养基、接种密度和灌流参数可能影响最终结果，实际应用前仍需结合目标工艺完成验证。