拒绝非特异干扰！Elabscience 流式辅助试剂让实验结果更可信

在流式实验中，我们不仅需要关注流式抗体荧光的合理搭配，还需要选择合适的辅助试剂来完成最佳染色。在多色流式实验中，辅助试剂的合理使用可以降低荧光背景，提高信号特异性等，能直接影响到实验结果的准确性和可重复性。今天，Elabscience就和大家分享几个容易被忽略的辅助试剂使用技巧，助您轻松优化流式结果！

Fig. 1. 流式辅助试剂及其相应作用

1. 样本处理类试剂

1) 样本处理试剂。样本处理的核心目标是对样本进行预处理，使其满足流式细胞仪检测的要求，即获得单细胞悬液的同时，保证检测的目的细胞数量足够多，细胞活力好，抗原表位完整。在进行样本处理时，可利用红细胞裂解液对样本进行红细胞裂解，避免红细胞干扰实验结果，也可使用Ficoll分离液得到目的细胞。

未裂红

红细胞裂解

Ficoll分离液处理

Fig. 2. 不同处理下淋巴细胞检测结果图（左图未裂红处理，中图经过红细胞裂解液处理，右图经过Ficoll分离液处理）

2) T细胞活化与扩增。为了评估T细胞的功能与状态，在检测前通常需要对T细胞进行活化并使其增殖。抗CD3抗体和抗CD28抗体作为T细胞激活的第一和第二信号，用磁珠偶联CD3/CD28模拟了抗原呈递细胞（APC）的自然激活方式，比传统的直接将抗体加入培养基方法相比，更接近自然生理状态的激活，能够提供持续且稳定的刺激信号，降低T细胞耗竭风险。

Fig. 3. 激活前和激活2天后检测人T细胞CD25和CD69的表达结果

Fig. 4. CFSE染T细胞后培养3天（额外添加IL-2细胞因子），检测未激活组和激活组T细胞的增殖结果

2. 染色类试剂

1) 染色缓冲液。流式染色缓冲液中含有BSA，能减少抗体或荧光染料与细胞的非特异性结合，也可在离心等步骤中减少细胞间的剪切力，起到保护细胞和降低细胞损失的作用，适合用于胞内流式染色。

2) Fc受体封闭剂。使用Fc受体封闭剂能减少非特异性抗体结合，优化信噪比。

Fig. 5. Fc受体封闭处理检测结果展示。绿色：THP-1细胞未使用Fc受体封闭剂，直接染色PE Mouse IgG2a,κ Isotype Control [C1.18.4]；红色：THP-1细胞使用EasyStain™ Human Fc Receptor Blocking Solution后染色PE Mouse IgG2a,κ Isotype Control [C1.18.4]

3) 胞内因子染色。细胞因子蛋白检测需要相关的刺激阻断剂与固定破膜剂，刺激剂能够激活T细胞，促进细胞因子分泌；阻断剂能够阻断细胞因子停留在高尔基体中，抑制细胞因子分泌到胞外。固定破胞膜试剂不仅能有效地获得胞内信号，同时也能减少对表面指标抗原的破坏。

A

B

Fig. 6. Cell Stimulation and Protein Transport Inhibitor Kit刺激人PBMC 6 h后，用Elab Fluor® 488 Anti-Human CD4 Antibody[SK3]流式染色，经过Intracellular Fixation/Permeabilization Buffer Kit固定和破膜后用APC Anti-Human IFN-γ Antibody[B27]（A）和PE Anti-Human IL-4 Antibody[MP4-25D2]进行流式染色（B）

4) 核内因子染色。核内因子染色需要用到固定破核膜试剂，核内指标，如Foxp3、RORγt、Bcl-6等，同时也能与细胞因子指标兼容，如IFN-γ、IL-4和IL-17A。

A

B

Fig. 7. 小鼠脾脏细胞经过APC Anti-Mouse CD4 Antibody[GK1.5]表面染色后，经过Foxp3/Transcription Factor Staining Kit固定破膜后用PE Anti-Mouse Foxp3 Antibody[3G3]（B）以及PE Mouse IgG1, κ Isotype Control[MOPC-21]（A）进行染色

3. 细胞死活染料

死活染料主要分为核染料和胺类染料。核染料是利用活细胞的膜选择透过性来区分死细胞和活细胞，只能适用于表染流式实验，无法适用于胞内、核内流式实验。对于需要固定破膜的样本，需要用到蛋白染料，即胺类染料。胺类染料能与活细胞表面的伯氨基结合，当细胞发生死亡时，细胞膜破损，染料可结合细胞膜表面和细胞质中的伯氨基，因此死细胞的荧光强度强于活细胞，从而区分死细胞和活细胞。

Fig. 8. 相同样本排除死细胞前后结果对比（A组未加死活染料染色，B组加入PI染料进行染色）。死细胞易与抗体或者荧光素发生非特异性染色，影响目的细胞的比例。

Fig. 9. 死细胞干扰特征示意图。死细胞在图上沿对角线分布（Dead cells）。死细胞的自发荧光在多个荧光通道均有信号，短波长（蓝/绿）通道干扰显著，经常是呈现“彗星尾”状或弥漫性地向高荧光方向拖尾、扩散。

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