从方案到实操，Elabscience ROS 检测全攻略，新手也能轻松上手～

在细胞生物学、疾病机制研究及药物研发等领域，活性氧（ROS）的精准检测是揭示氧化应激相关机制的核心手段。如何精准捕捉ROS的动态变化，成为科研与药物筛选中的关键一环。

Elabscience今天帮您梳理ROS检测的核心方法、适用场景，并聚焦明星探针DCFH-DA的常见问题，助您快速建立可靠检测体系。

1 、活性氧检测应用及方法

活性氧（ROS）是一类具有高反应活性的含氧物质，主要包括超氧阴离子（・O₂⁻）、过氧化氢（H₂O₂）、羟基自由基（・OH）和单线态氧（¹O₂）等。它们在细胞中扮演 “双刃剑” 角色：低浓度时作为信号分子调控细胞增殖、分化等生理过程；高浓度则引发氧化应激，导致核酸损伤、蛋白质变性及脂质过氧化，进而参与动脉粥样硬化、癌症、神经退行性疾病等多种疾病的病理进程。

ROS 检测主要应用于：

①　量化细胞 / 样本的氧化应激水平，评估抗氧化系统功能；

②　揭示疾病发生发展中氧化应激的作用机制；

③　为药物筛选、毒性评价及抗氧化剂研发提供关键指标。

图1. 活性氧种类及其细胞内来源[1]

2、 ROS检测方法怎么选？

目前检测ROS常见的有荧光法和电子顺磁共振，其在适用场景及检测目标上存在差别，对比如下表：

荧光法因操作灵活、兼容多种平台（荧光显微镜、流式细胞仪、酶标仪），成为最常用的ROS检测手段。可根据不同的研究目标，样本类型及检测仪器选择不同的原理（例如DCFH-DA，DHE，线粒体靶向探针，过氧化氢特异性探针）进行检测。

3 、ROS 检测方案选择

氧化应激整体水平评估——DCFH-DA 探针

可响应 H₂O₂ 、・OH、ONOO⁻等多种 ROS，生成绿色荧光。适配荧光显微镜、流式细胞仪等多仪器。无需明确 ROS 类型即可快速获取细胞 / 样本的总 ROS 状态。适合药物初筛、不同处理组氧化应激水平比较等场景。

特定 ROS 类型研究——特异性探针

若聚焦超氧化物，可选择线粒体靶向探针，产生明亮的红色荧光。避免其他 ROS 或活性氮（RNS）干扰，适合线粒体氧化应激研究（如线粒体功能障碍相关研究）。

4、 仪器选择建议

荧光显微镜/共聚焦显微镜

适合 ROS 亚细胞定位研究，如观察线粒体 ROS 分布、ROS 在细胞凋亡过程中的动态变化。搭配特异性靶向探针（如检测线粒体超氧化物），可清晰呈现 ROS 在不同细胞器的分布差异。

流式细胞仪

适合大量细胞的 ROS 定量分析，可获取单个细胞的 ROS 信号，进行统计分析（如计算阳性细胞比例、平均荧光强度、荧光强度标准差）。此外，可同时联合细胞表面标志物、凋亡指标（如 Annexin V/PI）进行多参数检测，揭示 ROS 与细胞表型、细胞存活的关联。

荧光酶标仪

采用96 孔板 检测，适用于高通量筛选（如药物库筛选、不同浓度处理组比较）。

5、 DCFH-DA 检测常见问题与解决方案

DCFH-DA 是ROS 检测最常用的探针，其操作简便但易受多种因素干扰，以下针对其检测过程中的高频问题提供解决方案：

Q1: DCFH-DA使用浓度和探针装载时间？

A：需通过预实验探索确定，不同的细胞系和实验设计会有差异。一般推荐初始工作浓度为10 μM，探针装载时间为30 min。

Q2：细胞样本本身有荧光对结果有影响吗？请问用荧光酶标仪测出的荧光强度值范围是多少呢？

A：DCFH-DA反应后的物质是强绿色荧光，如果样本自身也携带绿色荧光，那么使用该试剂盒检测就有干扰，其他颜色的荧光物质是没有影响的，推荐使用DHE探针（红色荧光）；不同仪器检测的信号放大程度不同，荧光值也不同，且数值差异可能比较大，因此没有确定的范围作为参考。

Q3：DCFH-DA能否检测血清、组织匀浆中的ROS？

A：不能，DCFH-DA一般检测的为活细胞中 ROS，因此，只能用于活细胞或新鲜组织（组织制备成单细胞悬液）的检测。

Q4：组织样本制备单细胞悬液，需要的组织量是多少呢？酶消化液是加多少呢？

A：需要的组织的量能保证最后细胞量达到 105-106 就可以，一般来说，0. 1 g 组织是足够的。加入酶消化液的量只要能淹没组织即可。

Q5：使用荧光显微镜检测，细胞能不能直接用孔板拍不用爬片？组织也是直接用荧光显微镜拍吗？

A：如果实验室配备有倒置显微镜的话，是可以直接用皿拍照的，不需要做爬片。如果检测组织样本的话，建议选取新鲜的组织样本制备为单细胞悬液后检测。制备为单细胞悬液后，不建议使用显微镜检测，可能会影响拍照效果。对于组织样本，建议使用荧光酶标仪或者流式细胞仪检测。

Q6：使用荧光酶标仪检测得到的结果，应该如何计算？

A：DCFH-DA检测细胞ROS不是定量检测，不用计算，最后直接比较荧光值的大小，荧光值的大小代表 ROS 的水平高低。

Q7：如果检测样本分为不同组，不同组之间需要分别做阳性和阴性对照组吗？

A：如果样本没有背景荧光干扰的话，只需要选取正常组样本设定阴性对照孔和阳性对照孔，模型组不需要。

参考文献：

[1] Manoharan RR, Prasad A, Pospíšil P, Kzhyshkowska J. ROS signaling in innate immunity via oxidative protein modifications. Front Immunol. 2024;15:1359600. Published 2024 Mar 7. doi:10.3389/fimmu.2024.1359600

ROS检测并不难，关键要选对方法+用对探针+避免常见坑。无论是初筛还是深研，清晰的目标和合适的工具都能助你事半功倍。

希望这份指南能帮你理清思路！如果你在ROS检测中遇到过其他“神坑”，或是有其他心得，欢迎在评论区留言分享～也记得关注我们，获取更多科研实用干货！