数据挖掘—植物物种鉴定及引物设计

数据挖掘—植物物种鉴定及引物设计

需求：使用PCR的方法鉴定样品中是否含有南瓜的成分

方法：

• 为实现对南瓜属（Cucurbita）成分的检出，本研究基于叶绿体 DNA 条形码技术，采用 rbcL 与 matK 双位点联合检测策略。rbcL 基因具有高度保守性，适用于植物 DNA 的初筛检测；matK 基因进化速率较快，在属级水平具有较高的分辨能力。
• 只使用PCR的方法无法进行精确到种，如果需要精确的物种鉴定，需参考16s的测序方法（动物一般用COI基因，植物一般用rbcL+matK，及DNA条形码技术）

1.目的基因序列获取

• NCBI中检索Cucurbita pepo 叶绿体基因组序列，NC_038229.1，并下载其fasta序列，并确定rbcL 与 matK 基因的位点，根据位点信息提取目标序列。可以使用snapgene，可以比较方便的注释基因位置

• rbcL：位置信息（58696-60144）

• matK：位置信息（2008-3519），注意在互补链上

• snpgene中标注

rbcL:

matK:

2.引物设计

• 分别将rbcL，和matK（需反向互补），序列使用NCBI primer blast，进行引物设计，选择较为合适的引物
• 以matK为例

• 选择较为合适的引物，如

• 在Snapgene中标注清楚

• 将扩增后的序列，重新进行blast比对

#matK序列注意反向互补
#可以使用在线工具https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html 
TGATCGATTTGTGCGTATATCCAGAAATCTTTCTCATTATTACAGAGGATCCTCAAAAAAAAAGAATTTGTATCGAATCCAGTATATACTTCGCCTTTCTTGTCTTAAAACTTTGGCTCGTAAACACAAAAGTACTGTACGCGT

3.讨论

• 实际上选择的rbcL引物扩增出来的模版，进行blast结果，如下

top hit是：Apodanthera（葫芦科），Halosicyos（葫芦科），Doyerea（葫芦科），Cucurbita（南瓜属）

• 这个原因并不是引物质量不好，而是：rbcL 这个位点本身的分辨率有限，从结果上看
  • 不适合作为“南瓜属（Cucurbita）专一引物
  • 可以作为“葫芦科（Cucurbitaceae）通用检出引物
  • 单独使用，不能直接得出“检出南瓜属 DNA”的结论
• rbcL + matK 组合使用
  • rbcL：高灵敏度，检出是否存在“葫芦科/南瓜类植物 DNA”
  • matK：变异度更高，用于将结果进一步收敛到 Cucurbita
• PCR 扩增产物经 Sanger 测序后，采用 BLASTn 程序在 NCBI nt 数据库中进行序列比对分析。结果显示，rbcL 扩增序列主要匹配葫芦科（Cucurbitaceae）植物，用于确认样品中植物来源 DNA 的存在；matK 扩增序列的比对结果高度收敛至南瓜属（Cucurbita），序列一致性均达到 98% 以上，能够实现对南瓜属 DNA 的可靠鉴定。