RNA测序数据怎么定量？一篇给小白看的“白话”综述

把 RNA-seq 数据变成“每个基因/转录本有多少分子”这件事，目前主流有三条路：

1. 1. 先比对再数 reads（alignment-based）；
2. 2. 不比对直接“扔骰子”估计分子数（pseudoalignment）；
3. 3. 用长读长技术直接数全长分子（long-read）。 下面按“原理—工具—注意事项—参考文献”的顺序聊，保证能看懂，能上手，能避坑。

一、为什么要“定量”而不是简单数 reads？

早期 RNA-seq 就是把 reads 比对到基因组，然后用 featureCounts 或 HTSeq-count 数落在每个基因上的 reads 数（Anders, 2015）。 问题：

• • 一条 read 可能同时匹配多个转录本（多重比对）。
• • GC 含量、基因长度、测序深度不同都会带来偏差（Dillies et al., 2013）。 因此，大家转而用概率模型把 reads 按概率分配到各转录本上，最后给出 TPM（每百万转录本数）或 expected count（期望计数），这才算“定量”。

二、短读长数据的两大门派

1. Alignment-based 经典流程

Li & Dewey 2011 年提出的 RSEM 是目前最常用的“比对+期望最大化”框架（Li & Dewey, 2011）：

• • 利用 Bowtie/STAR 把 reads 比对到“转录本参考序列”；
• • 用 EM 算法把多重比对 reads 按概率分配到各 isoform；
• • 输出 TPM + expected count。 优点：有成熟的下游差异分析生态（DESeq2、edgeR）。 缺点：比对步骤慢，硬盘大户。

2. Pseudoalignment 光速流派

Patro 等 2017 年的 Salmon 把“参考转录本”切成 k-mer 并建立索引，reads 过来后直接查字典，省掉比对（Patro et al., 2017）。

• • 速度提升 20–50 倍；
• • 内置 GC-bias、片段长度修正；
• • 输出同样是 TPM / NumReads。

Kallisto（Bray et al., 2016）思路类似，两者精度与 RSEM 几乎无差（Bray et al., 2016）。 小白上手建议：电脑一般就直接 Salmon / Kallisto，跑得快，硬盘省，命令行友好（Smith, 2019）。

三、长读长数据：直接数全长转录本

PacBio Iso-Seq 或 ONT 直接测出整条 mRNA，理论上不用再“猜”isoform。但实测发现：

• • 长读错误率高，需要校正；
• • 建库偏好仍在，需要定量模型（Jain et al., 2018）。

近两年出现了 IsoQuant（Prjibelski et al., 2023）和 Bambu（Chen et al., 2023）这类工具：

• • 先把长读比对到基因组，再用图模型或机器学习把 reads 聚成“可信转录本”；
• • 计算每个 isoform 的分子数，输出 TPM / read count（Prjibelski et al., 2023）。

系统评估显示，长读长定量在复杂基因位点（>10 isoforms）时比短读更准（Chen et al., 2023）。

四、结果怎么看？单位科普

差异分析工具（DESeq2、edgeR）只吃 raw counts，它们自己会做归一化（Love et al., 2014）。

五、常见坑位提醒

1. 1. 参考基因组/转录本版本要一致 GENCODE v39 vs vM28 混用会导致定量天差地别（Frankish et al., 2021）。
2. 2. 重复序列多的基因（例如 SNORD 簇） 短读几乎无法区分，长读或靶向捕获更靠谱（Zhang et al., 2020）。
3. 3. 单端 vs 双端 Salmon/Kallisto 都能吃单端，但差异分析时记得在 colData 里标注（Smith, 2019）。
4. 4. ERCC spike-in 如果实验加了外部 RNA 标准品，可用它来评估定量线性范围（Jiang et al., 2011）。

六、思维导图总结

七、参考文献

• • Anders, S. (2015). HTSeq documentation: counting reads in features. HTSeq GitHub.
• • Bray, N. L. et al. (2016). Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification. Nature Biotechnology, 34, 525–527.
• • Chen, Y. et al. (2023). Context-aware transcript quantification from long-read RNA-seq data with Bambu. Nature Methods.
• • Dillies, M. A. et al. (2013). A comprehensive evaluation of normalization methods for Illumina high-throughput RNA sequencing data analysis. Briefings in Bioinformatics, 14, 671–683.
• • Frankish, A. et al. (2021). GENCODE 2021. Nucleic Acids Research, 49(D1), D916–D923.
• • Jain, M. et al. (2018). Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. Nature Biotechnology, 36, 338–345.
• • Jiang, L. et al. (2011). Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Research, 21, 1543–1551.
• • Li, B. & Dewey, C. N. (2011). RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics, 12, 323.
• • Love, M. I. et al. (2014). Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology, 15, 550.
• • Patro, R. et al. (2017). Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods, 14, 417–419.
• • Prjibelski, A. D. et al. (2023). Accurate isoform discovery with IsoQuant using long reads. Nature Biotechnology.
• • Smith, T. (2019). Salmon vs. Kallisto: a quick guide for beginners. Biostars Blog.
• • Zhang, Y. et al. (2020). Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology, 9, R137.

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