病毒对微生物群落及其生态功能有多大影响？

近两年在微生物组学领域，病毒获得了越来越多的关注。由于病毒个体微小，无独立代谢能力，目前对其所知甚少。研究者可以使用宏基因组数据挖掘潜在的溶源噬菌体，或者富集游离的病毒进行测序。尽管很多研究已经暗示病毒在环境中具有很高的丰度及多样性，且病毒基因组上的辅助代谢基因可能对生物地球化学循环有着重要的作用，然而病毒到底有多大的生态作用仍很难直观展现，因此也引起了很多研究者的质疑。本篇研究在海水环境中较为直观的展现了病毒对生物地球化学循环的影响，进一步加深了人们对于病毒生态功能的认识。

Cyanobacteria and cyanophage contributions to carbon and nitrogencycling in an oligotrophic oxygen-deficient zone

蓝藻和噬蓝藻体促成寡营养缺氧区域的氮碳循环

作者：ClaraA. Fuchsman • Hilary I. Palevsky •Brittany Widner et al.

期刊：The ISME Journal

时间：27 June 2019

文章摘要

多达一半的海洋氮损失发生在缺氧区域。来自富有生产力的表面水体的有机质流通被认为是氮气产生的主要控制因素。本研究调查了东北热带太平洋离岸海域，在这里的缺氧区域存在第二个叶绿素a峰值。缺氧区域的初级生产力以及来自混合层的碳输出速率与第一个叶绿素峰值处的生产力是一致的。然而，沉积物捕获碳和氮的流量在105和150米之间是逐渐上升的，表明在缺氧区域内部有有机质生成。宏基因组和宏蛋白组的分析表明第二个叶绿素峰值归功于蓝藻中的原绿球藻，许多光合作用以及固碳的蛋白质被检测到。缺氧区域内化能自养的氨氧化古菌、能氧化亚硝酸盐的Nitrospina以及硝酸氧化还原酶的出现与蓝藻的氧气产生是一致的。沉积物捕获的大颗粒（>30μm）中可以发现蓝藻和噬蓝藻体。颗粒中噬蓝藻体与宿主的比率超过50%，表明病毒能够促使蓝藻转化为沉降的有机质颗粒。硝酸盐还原和厌氧氨氧化也被检测到，与之前报道的氮气产生是相符的。本研究认为厌氧区域内的有机质生产能够促进氮气的产生而造成氮损失。

研究背景

自从1980年，由于太平洋氧气利用率的增强，氧气含量逐渐降低。模型预测显示太平洋氧气1%的减少会对其缺氧区域的大小产生加倍的影响。确实，重复的测量表明东北热带太平洋的缺氧区域在过去的40年增厚了，并且侵入到浅水区域。缺乏氧气作为电子受体的情况下，氧化态的氮可以通过两个途径被还原成氮气：异养的反硝化作用和自养的厌氧氨氧化作用。两个途径都依赖于有机物，反硝化作用需要直接使用有机物作为产能底物，而厌氧氨氧化则间接利用有机物降解产生的氨来进行代谢。在环境中，有机质通量与氮气的产生有相关关系。在海洋缺氧区域，添加无菌的沉积物捕获材料能够显著提高反硝化作用与厌氧氨氧化作用。事实上，多达一半的由于氮气产生造成的海洋氮损失发生在缺氧区域。因此，缺氧区域体积的扩大可能会造成氮损失的增加，对全球的初级生产者产生氮限制。

由于循环的迟滞，大多数缺氧区域是离岸的，其初级生产力低于沿海的十分之一。通常，离岸和沿岸的负责制造有机物的浮游植物群落是不同的，沿岸区域真核浮游植物更多，而离岸的海中蓝藻占优势。考虑到蓝藻细胞更小、生产力较低，离岸海中初级生产者的碳输出应该更小。然而，除了表层海水的有机物生产，蓝藻中的原绿球藻可以在所有的厌氧区域内被发现，形成水面下第二个叶绿素a峰值。分子学证据表明这些蓝藻是可以低光度生长的原绿球藻的近亲，在这个区域可以检测到有机物的生产。厌氧区域原位的初级生产可能显著提高有机碳从而促进氮损失。本文将展示，初级生产的测量、宏蛋白组与宏基因组的分析强烈支持这一设想。然而将原绿球藻产生的有机碳传递至异养反硝化细菌的途径目前并没有了解清楚。病毒很可能被牵涉进海洋的碳循环当中，以往研究表明蓝藻病毒的丰度与寡营养海域的有机碳流量强烈相关。通过对微粒中蓝藻病毒的丰度及组成的解读，本研究认为，这些病毒担当着将活细胞转化为下沉的有机质颗粒的角色。

材料方法

1. 样品采集

本研究使用附有多种传感器的尼斯金采样瓶进行采样，同时测量电导率、温度、深度、氧气、叶绿素等信息。三个自由浮动的、表面拴绳的沉积物捕获装置被布置在BB2站点，用于检测105、150和750 m处的氮、碳流量。

2. 生产力测量

如图1所示，从沿海到开放海域依次取样进行三氧同位素以及氧气/氩气溶解气体分析，用于分析总的初级生产力GPP和净群落生产力NCP。净初级生产NPP则使用稳定同位素13C标记培养法进行分析。

3. 宏基因组

使用二代测序分析136和BB2站点不同深度的微生物群落。在BB2站点，样品首先过30微米滤膜，然后过0.2微米的滤膜，分别用于DNA提取。

4. 宏蛋白组

在BB2站点的不同深度原位使用4mm筛网过滤海水，将捕获的沉积物样品用于宏蛋白组分析。

图1. A 采样期间平均叶绿素分布卫星图，灰色实线为存在缺氧区域的海域，红色点为进行三氧同位素以及氧气/氩气溶解气体分析采样位点，粉色点为使用稳定同位素13C标记培养位点。B BB2位点的沉积物捕获数据，虚线为缺氧区域边界，方框内为136和BB2位点。C不同距离采样点垂直截面的叶绿素a含量，最右边为沿海水域，最左边为距离海岸最远处水域。黑横杠为混合层的深度，红横杠为缺氧区域的顶部。

结果讨论

1. 生产力与输出

叶绿素a含量在沿海水域浓度最高，但是随着与海岸距离增大，其含量急剧下降，基于三氧同位素和13C估计的净初级生产力NPP的测量结果与其一致（图1A、C）。绝大多数离岸的区域拥有两个叶绿素a峰值，且均位于混合层之下，第二个叶绿素峰值位于缺氧区域（图1C）。在0-75m深度内，NPP与叶绿素a的浓度呈正相关（图2）；在离岸海域，来自混合层的碳输出只占其NPP的1-13%，说明第一个叶绿素峰值固定的碳大部分都在混合层进行循环，只有很少部分沉降到混合层以下（图1C）。但第二个叶绿素峰值的碳固定很可能有重要影响，尽管在105m处碳输出仍低于混合层底部，沉积物捕获数据显示在150m左右碳流通远高于105m处，表明在缺氧区域内很可能存在原位的碳固定，这与缺氧区域内第二个叶绿素峰值是相符的（图2）。

图2. 初级生产、自养细菌以及远海水柱特征。A BB2位点处光合成有效辐射PAR与水体密度随深度的变化。 B BB2位点处叶绿素a与可交换氧含量STOX以及三个离岸位点NPP在不同深度的变化。 C 136位点宏基因组获得的蓝藻RNA聚合酶rpoB、利用氧的氨氧化古菌AOA以及亚硝酸盐氧化菌Nitrospina随不同深度的变化。

2. 缺氧区内及之上的浮游群落

根据宏基因组测序数据，使用PsbD蛋白基因来鉴别光合自养微生物。第一个叶绿素峰值包含真核藻类和蓝藻，而第二个叶绿素峰值则完全是蓝藻，其中原绿球藻占优势（图3A、B）。与两个叶绿素峰值相对应，蓝藻的丰度同样具有两个峰值。使用rRNA ITS进一步鉴别原绿球藻的不同基因型发现，在缺氧的第二个叶绿素峰值处主要为原绿球藻LLIV/LLV，在已有研究中该分支具有低光度下生长的潜力（图3B）。宏蛋白组的数据显示，第二个叶绿素峰值处有大量原绿球藻光合作用相关蛋白，暗示该处具有初级生产力（图4A）。

图3. 水柱以及颗粒中光合自养生物的多样性。A 不同深度四种真核藻类丰度的变化。 B 不同深度原绿球藻和聚球藻不同基因型的丰度变化。 C 不同深度颗粒物中四种真核藻类的丰度。 D 不同深度颗粒物中原绿球藻和聚球藻不同基因型的丰度变化。

3. 颗粒中的蓝藻

为了调查是否缺氧区域的蓝藻能够贡献于沉降的有机质颗粒，本研究分析了大于30微米颗粒的宏基因组数据。研究发现在颗粒中存在蓝藻，尤其是在100m处。颗粒物中优势物种属于原绿球藻LLIV/LLV以及聚球藻CRD1，前者为缺氧区域水体中的主要物种，后者则出现在混合层有氧水体中（图3D）。在颗粒物中，聚球藻很可能来自混合层的沉降，而原绿球藻则来自缺氧区域原位的水体。对50m处有氧水体、100m缺氧水体以及105m颗粒物中的蓝藻多肽进行分析，发现颗粒物中67%的蓝藻多肽来自于缺氧水体，表明缺氧水体原位的碳固定可以转化为沉降的有机质（图4C）。

图4. 宏蛋白组数据表明缺氧区域有活性的蓝藻生产以及缺氧区域蓝藻群落对颗粒物的贡献。 A 在100 m深度检测到的涉及初级生产的蓝藻蛋白。 B 50 m有氧水柱、100 m缺氧水柱和105 m沉积物中检测到的肽类比较 C 50 m有氧水柱、100 m缺氧水柱和105 m沉积物中检测到的蓝藻肽类比较。

4. 病毒造成蓝藻的死亡

侵染蓝藻的病毒通常称之为噬蓝藻体。无论在自由生长的细胞还是颗粒物内，都能检测到噬蓝藻体的DNA聚合酶基因（图5）。进一步区分不同的病毒基因型发现，有氧区域与缺氧区域的噬蓝藻体群落并不相同（图5A）。进一步分析病毒与宿主的比率，发现颗粒物中病毒与宿主（也即噬蓝藻体与蓝藻）的比率远大于相同深度的水体。已有研究表明，病毒侵染能够造成噬菌聚集并形成颗粒。在缺氧水体颗粒物中不同病毒的比例与缺氧水体相近，而不同于上层的有氧水体（图5C、D）。这进一步表明，缺氧水体的沉降有机质颗粒并非来自上层的有氧水体，而是来自缺氧水体本身。病毒的侵染以及裂解蓝藻能够为缺氧水体带来沉降有机质，增加碳输入。

图5. 颗粒以及水柱中噬蓝藻体的普遍性。A 不同类型病毒DNA聚合酶随深度的变化。 B 细胞内（>0.2μm）、颗粒物内（>30μm）以及自由生长的微生物（<30μm）中病毒与宿主的比率随深度的变化。 C 不同深度颗粒宏基因组中病毒DNA聚合酶的丰度 D 不同类型的病毒DNA聚合酶在缺氧区域水体以及颗粒物中比例的对比。

5. 原位生产力对氮循环的影响

与缺氧水体内活性的蓝藻产氧光合作用观测结果一致的是，在105m第二个叶绿素a峰值处检测到了瞬时的毫摩尔级的氧气浓度（图2B）。光合作用的产氧可能会促进一些需氧生物生活在缺氧水体内。在非常低浓度氧气条件下，氨以及亚硝酸的氧化就可能存在。宏基因组结果显示需氧的化能自养亚硝酸氧化菌Nitrospina与蓝藻共存于缺氧水体中，同时还发现了需氧的氨氧化古菌Thaumarchaea（图2C）。因此，原绿球藻的出现可能会有助于缺氧水体内氨与亚硝酸的氧化。而在第二个叶绿素a峰值下面145m、160m、250m水体均检测到了反硝化以及厌氧氨氧化作用的酶，这与以往研究中观测到的缺氧水体内产生氮气造成氮损失的结论是相符的。

6. 碳流通与氮气产生

在离岸海域，尽管上层水体初级生产力较低，所能提供的碳输入很少，但仍能观测到下层缺氧水体中氮气的产生。从105m到150m，来自第二个叶绿素a峰值处的沉积的有机碳增加，从而促进氮气的产生。病毒侵染蓝藻使细胞聚集并裂解从而形成沉降的有机质颗粒，极大促进了碳流通。有机质能为反硝化作用提高反应底物，而有机质分解产生的氨可以通过氨氧化、亚硝酸盐氧化以及反硝化作用产生氮气，从而造成氮损失。

总结评论

在远离海岸的海域，表层水体初级生产力较低，所固定的碳大部分均在有氧的混合层内循环。在下层的缺氧水体的上部105m处，存在具有初级生产力的第二个叶绿素a峰值，为缺氧水体提供了碳输入同时产生了低浓度的瞬时可交换氧气，促进了氨与亚硝酸的氧化。噬蓝藻体侵染蓝藻，将活细胞蓝藻转化为沉降的有机质颗粒，为下层的反硝化作用以及厌氧氨氧化作用提供底物，促进了缺氧水体内氮气的产生。在整个区域的氮、碳循环中，噬蓝藻体和蓝藻起着核心作用，噬蓝藻体担当着促进碳流通的角色。