进来抄作业 | 蹭诺奖热点，7分+基因集肿瘤分型思路

缺氧，作为19年诺奖，毫无疑问是近年来的研究热点。但是作为热点，意味着相关的研究或者文章肯定不会少。想要找到合适的，并且别人没做过的思路就显得比较难了。

今天给大家带来的是2021年10月发表在Fruont Immunol.上的一篇文章，题目为“Development and Verification of the Hypoxia- and Immune-Associated Prognostic Signature for Pancreatic Ductal Adenocarcinoma”，关于胰腺导管腺癌缺氧和免疫相关预后特征的开发和验证，文章思路（缺氧和免疫相关预后特征的开发和验证）可以给我们带来很多启发，一起来看看吧~

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期刊简介

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研究背景

胰腺导管腺癌 (PDAC) 恶性程度很高， 患者的预后极差，5 年总生存率（OS）仅为 5%。当务之急是发现PDAC患者的预后特征，从而实现患者分层和精准治疗。

缺氧是癌变微环境的主要特征，存在于大多数恶性肿瘤中，影响癌变和肿瘤发生。由于缺氧可通过诱导侵袭和耐药性等恶性表型影响 PDAC 患者的预后，因此在 PDAC-缺氧轴中发现更多的特征基因是必要的。更重要的是，将微环境作为一个整体可能会提供新的研究视角。

越来越多的研究表明缺氧和免疫状态之间的相互作用对 PDAC 具有一定的预后意义，但其机制尚未得到充分研究。本研究的目的是通过系统分析构建第一个缺氧和免疫相关的预后特征模型，以期将其纳入现有的临床分期系统并改善 PDAC 预后。

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研究结果

1、缺氧相关差异表达基因的无监督聚类分析

• 图 1A-C：由于具有不同缺氧水平的 PDAC 患者的预后各不相同，作者进行了无监督聚类分析以识别不同的缺氧模式并将患者分层为两个cluster。
• 图 1D：Kaplan-Meier比较两组的 OS，检测到这两个集群之间存在显着差异。 cluster 1 （缺氧程度高）：预较差； cluster 2 （缺氧程度低）：预后较好。

图1：缺氧相关基因的探索。(A)项目共识图代表了为缺氧基因选择的最佳簇数 ( k = 2)。(B)共识值范围从 0 到 1。(C)当簇数从k变为k +1 时，累积分布函数 (CDF) 曲线下相应的面积相对变化。k的范围从 2 变为 9，最佳k = 2。(D)缺氧簇 1 和簇 2 患者的生存曲线。

2、鉴定缺氧和免疫相关的差异表达基因（DEGs）

• 图2A-B：通过 Pearson 相关分析研究 PDAC DEGs 和缺氧标记基因、 PDAC DEGs和免疫标志基因的关系；
• 图 2C-F：分别对缺氧相关基因和免疫相关基因进行GO和KEGG富集分析，发现最富集的缺氧 DEG 与免疫相关，包括“T 细胞活化”、“T 细胞活化调节”、“淋巴细胞分化”和“淋巴细胞增殖”；
• 表明不同的影响PDAC预后的缺氧状态可能与免疫通路的激活有关。

图2 DEGs的识别和注释。基于来自 TCGA 和 GTEx 的数据，PDAC 中差异表达基因的热图(A)和火山图(B) 。(C)缺氧相关 DEG 的前 20 个 GO 分析。(D)缺氧相关 DEG 的前 20 个最丰富的 KEGG 分析。(E)免疫相关 DEG 的前 20 个 GO 分析。(F)免疫相关 DEG 的前 20 种最丰富的 KEGG 途径。

3、缺氧和免疫相关风险评分模型的开发和验证

• 图 3A-C：将缺氧相关的 DEG 与免疫相关的 DEG 相交（72个）；
• 进一步通过单变量 Cox 回归分析、多变量 Cox 回归分析和 LASSO 回归选择了 7 个基因来构建预后特征；
• 根据风险披风，并将 PDAC 患者分为高风险组或低风险组；
• 构建训练集和验证集；
• Kaplan-Meier 分析：相对于不同组中的低风险患者，高风险患者的 OS 显着降低。

图 3风险评分模型的构建与验证。

(A) LASSO 系数曲线。

(B)基于 OS 的最低标准，通过 10 倍交叉验证选择 LASSO 模型中的调整参数 (lambda)。

(C)七个选定基因的系数。

(D-F) TCGA 训练集的构建。(D) TCGA PDAC 队列的 OS。(E) TCGA 训练集的风险评分和 OS 分布。(F) TCGA 预后指数在 1、2 和 3 年的预后价值的生存依赖性 ROC 曲线验证。

(G-I) GEO 验证集 (GSE28735 和 GSE62452) 的构建。（G）GEO PDAC 队列的操作系统。(H) GEO 的风险评分和 OS 分布。(I) GEO 中预后指数在 1、2 和 3 年的预后价值的生存依赖性 ROC 曲线验证。

(J-L) ICGC 验证集的构建。(J) GEO PDAC 队列的 OS。(K) GEO 的风险评分和 OS 分布。(L) GEO 预后指数在 1、2 和 3 年的预后价值的生存依赖性 ROC 曲线验证。

4.验证7个特征基因的独立预后

• 图 4A：单变量 Cox 回归分析：发现其中五个对 PDAC 患者有害，其中两个对 PDAC 患者有益；
• 图4B：在七个基因的聚类热图上，发现风险模型与之前建立的缺氧聚类一致，这在一定程度上证实缺氧和免疫可能相互作用影响PDAC预后；

图4：七个特征基因的独立预后验证。(A)基于 TCGA 数据的单变量 Cox 回归分析的森林图。(B)无监督聚类的缺氧和免疫相关 DEG 热图。作为基因注释的缺氧簇、风险组和风险评分是相关的。（C-I）基于 TCGA 数据的每个缺氧和免疫相关 DEG 表达的 Kaplan-Meier 存活率。

5.探索风险模型与PDAC临床特征的相关性

• 图 5A-H：为了研究我们的风险模型是否与 PDAC 的临床特征相关，进行了 Wilcoxon 秩和检验，发现高风险组具有更晚期的 TNM 分期和更高的肿瘤分级；
• 图 5I，J：考虑到两个风险组之间预后相关的临床特征不同，作者进一步研究了风险模型是否与其他 PDAC 独立预后因素具有相似或更好的预测效度；
• 图 5K：进一步建立了一个列线图来预测患者的 OS，其中包含三个独立的预后因素，包括年龄、主要治疗、N 和风险评分；
• 图 5L-N：校准图表明列线图可以准确估计死亡率；
• 图 5O-Q：1 年、2 年和 3 年 OS 的列线图的 AUC 分别为 0.76、0.80 和 0.82；
• 上述结果表明，风险模型既可以作为独立的预后因素，也可以与现有的临床指标相结合。

图 5基于 TCGA PDAC 队列的风险模型与临床特征的相关性。风险评分与T分类（A）、分期（B）、分级（C）显着相关，与初始治疗（D）、肿瘤部位（E）、年龄（F）、肿瘤大小（G ）无显着相关性)和淋巴结侵袭(H)。(I)单变量生存分析和(J)临床特征的多变量生存分析。(K)列线图预测 PDAC 患者的 OS。对于每个患者，向上绘制四条线以确定从四个预测变量接收到的点。这些点的总和位于“总点”轴上。然后，向下画一条线以确定 PDAC 的 1 年、2 年和 3 年 OS 的可能性。(L-N)列线图内部验证的校准图。y轴代表实际生存率，x轴代表列线图预测的生存率。(O-Q)基于 OS 的列线图的时间相关 ROC。

6.风险评分模型中缺氧和免疫基因组的富集分析

• 图 6A-C：为了进一步验证风险模型在缺氧和免疫中的作用，作者进行了 GSEA 通路富集分析：发现高危组中富集了三个缺氧相关基因组，包括 WINTER_hypoxia_up、HALLMARK_hypoxia 和 HARRIS_hypoxia；
• .在六个免疫相关基因组中，三个在高风险组中富集（图 6D-F），另外三个在低风险组中富集（图 6G-I）。
• 由于与缺氧相关基因集相比，免疫相关基因集的富集更为复杂，因此作者需要进一步深入评估了关于免疫状态的风险模型。

图 6来自基因集富集分析 (GSEA) 的缺氧和免疫相关基因集的富集图。GSEA 结果显示(A) WINTER_hypoxia_up、(B) HALLMARK_hypoxia 和(C) HARRIS_hypoxia 中的基因集在高风险组中差异丰富。来自基因集富集分析 (GSEA) 的免疫相关基因集的富集图。GSEA 结果显示（D-F）中的基因组在高风险组中差异丰富，而（G-I）中的基因组在低风险组中差异丰富。

7、风险评分模型与免疫浸润的关系

• 图7A：高风险组：初始 B 细胞、CD4 记忆静息 T 细胞、调节性 T 细胞 (Tregs)、静息 NK 细胞、M0 巨噬细胞、静息树突细胞和活化树突细胞的免疫细胞浸润程度较高；低风险组：记忆B细胞、CD8 T细胞、滤泡辅助T细胞、单核细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、静息肥大细胞和嗜酸性粒细胞浸润程度较高；
• 图 7C-H：ESTIMATE 评分显示：高风险组的基质和免疫评分较低；
• 图 7I-P：在临床亚组分析中，在 T3T4、2 期、N1 和 2 级中，高危组的免疫评分和基质评分显着低于低危组；
• 高风险组的免疫检查点表达水平也显着低于低风险组（图 7B）。
• 综上：胰腺癌的不同风险组可以准确地提示免疫水平，并且高风险组患者的整体免疫反应水平低于低风险组。

图 7风险模型与免疫状态的关系。(A)两组22个免疫细胞亚基的免疫细胞浸润程度分析。(B)显示高风险和低风险患者之间不同免疫检查点表达的箱线图。(C-E)基于 TCGA 的风险评分估计。风险特征与免疫评分、估计评分和基质评分之间的关系。(F-H)免疫分数、估计分数和基质分数的散点图。不同免疫状态(I-L)和基质状态(M-P) 的分析在 TCGA PDAC 队列的高风险和低风险人群中及其与临床特征的相关性。（*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；****p < 0.0001；ns，p > 0.05）。

8.风险评分模型与PDAC突变之间的关系

• 高危人群的突变负荷（TMB）明显更高
• 4个PDAC突变基因（KRAS、TP53、SMAD4和TTN）在高危人群中突变频率更高，突变谱更丰富。
• 其他 6 个 PDAC 突变基因（CDKN2A、RNF43、MUC16、ATM、GNAS和HMCN1）在高风险组中的突变频率低于低风险组，并且具有狭窄的突变谱。

图 8 TCGA 数据库中 PDAC 患者基因突变频率。介绍了高风险组(A)和低风险组(B)与突变之间的相关性。每列代表个体患者。上面的条形图显示 TMB。右边的数字表示每个调节器的突变频率。右侧的条形图显示了每种变体类型的比例。

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模仿与超越

下面这篇文章是2022年2月发表在front genet上的文章，IF4.599分，文章思路和上文介绍的差不多，这是一篇“肾透明细胞癌缺氧和免疫相关指标的构建和验证”。

Front Genet. 2022 Feb 9;13:711142.

文章研究流程图

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思维发散

今天讲解的这个生信文章思路：缺氧和免疫相关预后特征的开发和验证，我们后面模仿的时候，也应将重点放在如何将缺氧相关基因或通路或其他纳入到生信文章的分析逻辑里，鉴于缺氧在肿瘤中的作用，多癌症类型均可尝试；关于【缺氧相关signatures】，小编还发现这种打开方式在缺氧影响肿瘤靶向治疗的文章中也有涉及。

Nat Genet. 2019 Feb;51(2):308-318.

作者基于缺氧相关signatures的打分方法评估不同样本的缺氧水平，探究了不同癌种间及同一癌种内部的缺氧异质性。作者进一步在泛癌中探究缺氧与基因组不稳定性之间的关系，结果发现缺氧与基因组的不稳定性显著升高相关，缺氧肿瘤表现出典型的驱动突变特征。