单核转录组测序(snRNA-seq)鉴定多核骨骼肌纤维的转录异质性

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文章信息

文章题目：Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers 期刊：Nature Communications 日期：2020年12月11日 DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-020-20063-w

摘要

尽管大多数细胞都包含单个核，但是诸如滋养细胞，破骨细胞和骨骼肌纤维之类的细胞类型却需要多核。多核化的一个优势是可以将不同的功能分配给不同的核，但是由于存在共享的细胞质，因此对多核组织内的转录异质性进行全面的研究一直是一项挑战。在这里，作者利用单核RNA测序（snRNAseq）来确定多核骨骼肌纤维内转录多样性的程度。小鼠骨骼肌的核在整个寿命过程中都具有轮廓，这揭示了在出生后发育以及衰老的肌肉中会出现独特的肌核种群。作者的数据集还提供了一个平台，用于发现与肌肉细胞罕见的特殊区域相关的基因，包括肌腱连接标记和在神经肌肉连接处表达的经过功能验证的因子。

这些发现表明，合胞体肌纤维内的肌核拥有调节肌肉生物学的独特转录谱。

介绍

骨骼肌在发育过程中通过单核肌肉祖细胞的融合而形成。成熟的多核肌纤维由不同的收缩和代谢机制组成，从而产生独立的肌纤维类型（IIb，IIx，IIa和I）。除了具有纤维类型的多样性外，骨骼肌还包含一个干细胞群（卫星细胞），可以在刺激下被激活，并最终与肌纤维或彼此融合，从而实现再生。骨骼肌功能的多核化要求缺乏实验验证，但解释包括每个核能够控制有限体积的细胞质，并且肌纤维区域执行需要局部转录本的特殊功能。

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结果

3.1 5月龄WT小鼠胫前肌的snRNA-seq

作者使用单核RNA测序（snRNAseq）从小鼠骨骼肌的核谱中获得对哺乳动物肌核异质性范围的了解。纯化了来自野生型小鼠的5个月龄小鼠胫前肌的细胞核，并使用10X Chromium系统构建了用于测序的文库（图1a）。作者对8331个核转录组进行了分析，从中无偏见的聚类揭示了骨骼肌中所有预期的主要细胞类型，包括肌核，卫星细胞，纤维原发性祖细胞（FAP），内皮细胞，平滑肌细胞，肌腱细胞和免疫细胞（图1b）。

图1 5月龄小鼠胫前肌的snRNA-seq

a. 从小鼠骨骼肌进行细胞核纯化和测序的示意图

b. UMAP上代表的snRNA-seq数据的无偏聚类

作者鉴定了属于多核肌纤维的数个肌核簇，其特征是表达了许多典型的肌核转录本，例如Ttn，Tnnt3，Mybpc1和Mybpc2（图1c），并形成了被传统骨骼肌单细胞分析所排除的群簇。肌核蛋白可通过肌纤维类型进一步区分，肌纤维类型由肌球蛋白重链基因家族不同成员的表达决定。胫骨前肌是一种快速收缩的肌肉，已知主要表达快速的肌球蛋白重链同工型Myh4（IIb型纤维）和Myh1（IIx型纤维）。与此相一致，通过这两个标记物的表达将最大的四个肌核簇进行了分组（图1c）。

• 图1c：UMAP和小提琴图显示了肌核群体的基因表达，包括Ttn（所有肌核），Myh4（IIb型肌核），Myh1（IIx型肌核），Chrne（肌核连接），Col22a1（肌腱连接）和Pax7（卫星细胞） 。中级肌核簇与它们各自的纤维型肌核结合在一起，产生小提琴图。y轴将表达水平显示为群集之间的概率分布。

作者使用单分子FISH（smRNA-FISH）验证了胫骨前肌MTJ处Col22a1和Adamts20的表达，从而证实了该肌核种群的定位（图1d）。这些数据表明NMJ和MTJ肌核的强烈的空间转录异质性，表明合胞体内的位置和相关的近端信号传导是转录谱的主要决定因素。

• 图1d ：Col22a1和Adamts20的smRNA-FISH在5个月的胫骨前纵切面上的代表性图像，显示转录产物在肌腱交界处的肌核中定位（n = 5）。绿色箭头显示Col22a1 + Adamts20 +核。比例尺：50μm（左面板），10μm（右面板）。

3.2 比目鱼肌以及出生后第21天胫骨前肌的snRNA-seq分析

为了测试肌核异质性是否取决于特定的肌肉类型，作者从比目鱼肌中抽出了5389个核。在这里，检测到的种群与胫前肌的种群一致，但还包括比目鱼肌的特征性的I型肌核（Myh7 +）（补充图6，补充图7a，b）。胫骨前肌和比目鱼肌数据的整合产生了纤维类型表达谱的全面图集，并显示由于这种类型的肌肉的独特活动，I型肌核最可能散开（补充图7c，d）。

补充图7：小鼠比目鱼肌的snRNA-seq以及与胫骨前肌的整合揭示了所有纤维类型的转录组。

• a，比目鱼肌中UMAP中代表的无偏核聚集，显示I型，IIa型和IIx型肌核。
• b，Myh7，Myh2和Myh1的特征和小提琴图显示了预期纤维类型中的丰富表达。Col22a1还标志着慢肌的肌腱连接。
• c，来自胫骨前肌和比目鱼肌的肌核种群的整合，表明I型肌核是最分歧的肌核种群。右面板显示左面板中的核是否起源于胫骨前或比目鱼。
• d，热图显示了在胫骨前/比目鱼综合数据集中存在的与肌肉相关的核种群中表达的最高基因。

直到小鼠成年为止，肌肉的生长和成熟一直持续到这一点为止，而且这种肌肉生长的过程如何影响累加的肌核中的转录尚不清楚。作者分析了来自出生后（P）第21天胫骨前肌的11,552个核转录组，以评估成熟的肌核的转录动力学。P21肌核以与成年小鼠不同的模式聚集，并且该聚集不仅仅可还原为纤维类型同一性（图2a）。除了IIb型，IIx型，NMJ和MTJ肌核外，还鉴定了另外两个肌核种群。进一步的肌核聚类显示出更具体的亚群，这些亚群与IIb型和IIx型肌核明显不同（图2b）。

图2a

图2b

图2c,d

图2在发育中的肌肉中发现了瞬时异质性。

• a. 在UMAP中，来自出生后（P）第21天的无偏核聚集表明，除了典型的IIb型和IIx型肌核外，还有独特的肌核之外的所有主要群。这些核种群分别以Nos1和Enah标记。
• b. 从P21肌肉对亚细胞核群进行亚簇化显示了肌小节组装的肌核状态。再分子亚群，出现肌小节组装体肌核
• c. 特征图，用于评估b中来自肌核群体的成熟肌肉标志物（Ttn，Myh1，Myh4和Ckm）和分化标志物（Myod1，Myog，Mymk）的表达。
• d. 小提琴图显示了肌小节装配体肌核，并丰富了与早期肌原纤维形成相关的转录谱（Nrap，Enah，Flnc，Myh9，Myh10，Fhod3的表达）。

P21肌小节组装肌核的一种解释是它们是最近融合的核，尚未确定其纤维类型。在这种情况下，这些肌节装配的肌核可能处于更不成熟的状态，并建议他们通过融合后成熟程序来确立其成年身份。另一种可能性是这些肌核状态在大多数肌核增生发生后被带入（约P21）。

3.3 出生后第10天胫骨前肌的snRNA-seq分析

为了区分这些可能性，作者在融合进行中从P10的胫前肌生成了8611个核转录组，最近融合的核将出现。在这里，作者无法检测到Enah +肌核种群的强大独立簇，而无法检测到类似于成年肌肉的肌核种群（图3a）。有趣的是，作者确实在P10处检测到一簇细胞，这些细胞接近卫星细胞，但在P21或5个月大时不存在。作者假设该亚群代表了成肌细胞（活化的卫星细胞），因为融合在P10进行。

图3a

图3。肌核转录状态在发育中表现出时间特异性。

• a. 代表来自出生后（P）第10天胫骨前部的snRNA-seq数据的UMAP显示存在激活的肌肉祖细胞（肌细胞），但不存在明确的肌小节肌核状态。

成肌细胞的存在表明在P10处正在进行融合，而在P21处该群体的缺失证实大多数融合在这些样品中终止。P10缺乏肌小节组装种群，这表明它们并不代表肌核从近端过渡到融合的成熟阶段，而是更多的核在骨骼肌融合后生长过程中响应生理刺激而采用这种状态。作者通过对来自P10，P21和5个月大小鼠的胫前肌进行smRNA-FISH验证了Enah +肌核在P21处的瞬时扩增（图3b）。在所有年龄段都存在Flnc和Enah表达，但与P10和5个月相比，P21中Flnc + / Enah +核的百分比显着增加（图3b）。

图3b

• b. Flnc和Enah的 smRNA-FISH显示，与P10和成年肌肉相比，P21胫骨前肌的肌节装配状态肌核的扩增。在每个时间点（n = 3）对Flnc + Enah +细胞核进行定量。数据表示为平均值±标准偏差。采用单向方差分析与Tukey事后比较来确定统计学显着性，** P <0.01。比例尺：20μm。

除了正常发育中发现的功能多样性外，转录异质性还可能是由与衰老相关的病理或代偿过程引起的。骨骼肌在功能恶化和再生衰退方面经历了与年龄相关的剧烈变化，因此作者接下来询问衰老过程是否影响了肌核转录。

3.4 24和30月龄小鼠的胫骨前肌snRNA-seq分析

作者剖析了24和30个月大的胫骨前肌的18,087核（图4a，b）。仅在30个月的肌肉中，作者观察到了在5或24个月内不出现的新生肌核种群，包括分别表达Nr4a3，Ampd3和Enah的簇（图4b）。作者整合了5、24和30个月的肌核，发现了一个与衰老相关的一致基因表达特征，包括在两个衰老时间点上调Nr4a3和Smad3（图4c），表明这可能是一种渐进性特征衰老的肌肉。Smad3与肌肉老化过程有关，而Nr4a3可能在代谢适应运动发挥作用，但尚未在衰老过程中进行研究。腓肠肌中Nr4a3的smRNA-FISH证实了老年肌中肌核中表达的升高，呈异质性模式（图4d）。

图4。在老年肌肉中，肌核之间的统一基因表达被破坏。

• a.来自24个月大小鼠胫前肌的snRNA-seq数据的UMAP，显示与5个月大时相似的簇。
• b.来自30个月大的肌肉的snRNA-seq数据的UMAP显示存在由Ampd3，Enah和Nr4a3标记的独特的肌核簇。
• c.来自5、24和30个月胫骨前肌的整合性肌核的热图，显示出衰老肌肉的一致转录特征。列是属于每个时间点的单个核。
• d.代表Nr4a3的smRNA-FISH的代表性图像证实了其在30个月骨骼肌的肌核中的上调（每组n = 3）。比例尺：10μm。
• e.在30个月的肌核内，Enah +群体的关键标记基因的特征图。

为了更系统地调查随时间推移的肌节神经节肌肌节的存在，并确定整个生命周期中核组成的模式，作者在10d、21d、5、24、30个月对来自胫骨前肌的snRNA-seq数据进行了整合（图5a）。值得注意的是，整合证实了Enah +和Ampd3 +种群的独立集群（图5a）。Enah +肌核存在于所有时间点，但在P21肌肉中却有所增加（图5b），这与作者的smRNA-FISH发现和对单个数据集的分析一致。有趣的是，作者还鉴定了一个表达大量骨骼肌特异性基因（例如Tnni2，Tnnt3，Ckm）的核（Ckm + Col1a1 +）以及参与细胞外基质重塑的标记基因（例如Col1a1，Col3a1，Col5a3， Col6a1和Dcn）（图5a，补充数据1）。该群体在发育中被过度代表，在P10时占4.7％的细胞核，而在5个月时占0.9％的细胞核（图5b）。该簇可以代表具有肌核以及成纤维细胞或肌腱来源的细胞特征的中间种群。

图5

图5

图5整个生命周期中snRNA-seq的整合揭示了肌核种群动态。

• a. 出生后第10天，P21天，胫骨前肌5个月，24个月和30个月的snRNA-seq数据的综合UMAP。
• b. 整个生命周期中核类型的比例构成。主要类别（FAP，内皮细胞，平滑肌）包括密切相关的亚群。将肌核组合（上图）和子集（下图）以显示肌核组成动态。

为了测试先前与NMJ不相关的基因的有效性，作者通过smRNA-FISH和NMJ标记乙酰胆碱的共标记确认了先前与NMJ不相关的4个基因（Ufsp1，Lrfn5，Ano4和Vav3）的定位受体（AchR）（图6a）。

图6

图6.先前未知的NMJ标记基因的发现和功能表征。

• a. 来自骨骼肌切片上Ufsp1，Lfrn5，Vav3和Ano4的smRNA-FISH的代表性图像显示与典型NMJ蛋白，乙酰胆碱受体（AChR）共定位（n = 3）。通过α-真菌毒素标记可以看到AChR。
• b. 对先前与正常肌肉（n = 4）和神经支配（n = 5）的NMJ不相关的指示基因进行定量实时PCR（qPCR）分析。

此外，作者发现，这里鉴定出的多个顶级NMJ基因在后肢去神经后的mRNA水平上发生了显着变化，这是一种与突触后调控相关的表达模式（图6b）。去神经支配后，这些基因的大多数表达增加，类似于经典的NMJ因子Musk49，Ufsp1和D430041D05Rik表现出表达减少，而Pdzrn4不变（图6b）。

为了评估这些因素对NMJ形成和维持的功能相关性，作者使用了一种体外培养系统，其中将C2C12成肌细胞涂在层粘连蛋白上时，会形成以AChR标记的非神经性NMJ样簇（图6c）。作者用对照siRNA或靶向Musk，Ufsp1，Vav3，B4galnt3或Gramd1b的siRNA处理C2C12细胞，然后进行AChR聚类分析。用适当的siRNA处理后，观察到靶基因的表达降低（图6d）。

• c. C2C12成肌细胞中siRNA筛选的示意图，旨在测试候选NMJ基因的功能。

减少麝香会阻止AChR聚类（图6e），显示系统的保真度50。对于减少了Vav3或B4galnt3的培养物，未观察到明显的AChR聚类异常，但已确定Ufsp1和Gramd1b是NMJ的调节剂（图6e）。Gramd1b的丢失导致AChR簇减少，而Ufsp1的减少引起AChR簇的增加（图6f）。这些数据表明，Ufsp1是AChR簇和NMJ形成的负调控因子，与其去神经后的下调一致。Ufsp1或Gramd1b的减少不会影响规范NMJ基因的整体成肌或转录水平（图6g），表明它们以转录独立的方式特异性调控NMJ。这些数据突出了核水平分辨率在发现调节骨骼肌生物学的因素中的效用。

分化后两天转染siRNA，三天后用α-菌丝毒素分析AChR簇，作为NMJ形成的替代物。

• d. 用siRNA靶向基因的qPCR分析。将加扰的siRNA用作对照。
• e. 用各种siRNA处理并用α-真菌毒素染色后的C2C12肌管培养物的代表性图像。细胞也用鬼笔环肽和DAPI染色。
• f. 每个视场对AChR簇的量化。
• g. qPCR分析与肌发生和NMJ形成相关的基因。比例尺：50μm（左上方面板），10μm（右上方和底部面板），e 50μm。

d，f和g中的数据来自三个独立的实验。所有数据均表示为平均值±标准偏差。使用未配对的双向t检验确定统计学显着性，*P <0.01，**P <0.001， P <0.0001。源数据作为源数据文件提供。

总结

• 骨骼肌的肌核分布图揭示了小鼠整个寿命中肌核状态的复杂转录动力学。
• 肌核的一个子亚群中存在独特的肌节装配转录信号，在发育中的肌肉中最为突出。
• 为专门的NMJ和MTJ群确定了许多基因，并提供证据，以前未表征的NMJ因子是突触后功能的功能调节器。

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